Koud Atmosferisch Plasma (KAP) voor inactivatie van pathogene biofilmen - Toepassing voor voedingsgerelateerde Listeria monocytogenes en Salmonella Typhimurium

Afgelopen decennia is het meer en meer duidelijk geworden dat pathogene bacteriën zoals Listeria monocytogenes en Salmonella Typhimurium, de doelmicro-organismen van dit doctoraatsonderzoek, op abiotische oppervlakken voornamelijk aanwezig zijn onder de vorm van biofilmen. Dit zijn functionele consortia van cellen die beschermd worden door een zelfgeproduceerde matrix van extracellulaire polymere substanties (EPS). Deze EPS matrix bevat voornamelijk polysachariden, eiwitten en extracellulair DNA en heeft verschillende eigenschappen zoals (i) het weerhouden van water en nutriënten, (ii) het vasthechten van bacteriën aan een oppervlak en (iii) het limiteren van de diffusie van antimicrobiële producten tot in de dieper gelegen lagen van de biofilm. Omwille van bovengenoemde redenen zijn bacteriële cellen die aanwezig zijn in een biofilm zeer resistent ten opzichte van de desinfectiemethoden die momenteel gebruikt worden voor abiotische oppervlakken. Hierdoor is het van groot belang om te onderzoeken of nieuwe desinfectiemethoden zoals het gebruik van Koud Atmosferisch Plasma (KAP) een mogelijk alternatief kunnen vormen voor deze inefficiënte traditionele behandelingen.

Plasma kan gezien worden als de vierde aggregatietoestand en kan gegenereerd worden door energie toe te voegen aan een gas. Op die manier wordt een (partieel) geïoniseerd gas bekomen dat bestaat uit verschillende (reactieve) deeltjes zoals ionen, fotonen, vrije elektronen, radicalen en geëxciteerde (neutrale) deeltjes. Wanneer een gas bij kamertemperatuur en op atmosferische druk wordt geïoniseerd door middel van een elektrische ontlading, wordt er een specifiek type plasma gevormd, namelijk KAP. Dit type plasma bezit enkele belangrijke voordelen: (i) de behandelingsduur is relatief kort, (ii) het kan gegeneerd worden bij lage temperatuur en (iii) de meeste primaire reactieve deeltjes verdwijnen onmiddellijk na de behandeling terwijl sommige secundaire (reactieve) deeltjes actief blijven voor een langere periode. Meer onderzoek is echter nodig om de efficiëntie van KAP voor inactivatie van biofilmen te onderzoeken. Dit doctoraatsonderzoek focust daarom op het nagaan van het effect van verschillende (plasmabehandelings)condities op de efficiëntie van KAP en het achterliggende inactivatiemechanisme.

In eerste instantie werden er sterk aangehechte en mature (referentie)biofilmen ontwikkeld voor twee pathogene micro-organismen, namelijk voor L. monocytogenes (Gram positief) en S. Typhimurium (Gram negatief). De aanhechting en de maturiteit van deze single-species biofilmen bleken afhankelijk te zijn van het gebruikte groeimedium, de incubatietemperatuur en de incubatietijd. Bovendien waren de optimale biofilmvormingscondities afhankelijk van het specifieke micro-organisme.

Deze (referentie)biofilmen werden initieel gebruikt om de invloed van verschillende plasmabehandelingscondities op de KAP-inactivatiedynamieken en -efficiëntie te onderzoeken. De biofilmen werden om die reden behandeld met KAP gedurende 0 tot 30 min en plaattellingen werden gebruikt in combinatie met predictieve modellen om de inactivatiedynamieken te beschrijven voor elke mogelijke combinatie van de geselecteerde plasmakarakteristieken. De gevarieerde karakteristieken waren (i) de samenstelling van het voedingsgas (helium + 0.0, 0.5 of 1.0% (v/v) zuurstof), (ii) de elektrodeconfiguratie (een Dielectric Barrier Discharge (DBD) of een Surface Barrier Discharge (SBD) elektrode) en (iii) de intensiteit van de plasmabehandeling (13.88, 17.88 of 21.88 V inputvoltage). Uit de resultaten kon opgemaakt worden dat de inactivatie van de biofilmen eerst log-lineair verliep, waarna een plateau werd bekomen door de aanwezigheid van een resistente subpopulatie. De inactivatiedynamieken en -efficiëntie werden echter beïnvloed door de geselecteerde plasmakarakteristieken. De hoogste log-reductie, van ongeveer 3.5 log10(CFU/cm²), werd bekomen wanneer geen zuurstof werd toegevoegd aan het voedingsgas en de DBD-elektrode werd gebruikt bij het hoogste inputvoltage.

Deze optimale KAP-behandeling werd vervolgens gebruikt om na te gaan of de KAP-inactivatiedynamieken en -efficiëntie beïnvloed worden door de maturiteit en de complexiteit van biofilmen. Om enerzijds meer mature biofilmen te bekomen werden de referentiebiofilmen, met een incubatietijd van 1 dag, geïncubeerd voor een langere periode (tot en met 10 dagen). Om anderzijds meer complexe biofilmen te bekomen werd een dual-species biofilm ontwikkeld die zowel L. monocytogenes als S. Typhimurium cellen bevatte. Uit dit onderzoek bleek dat zowel de dynamieken als de efficiëntie van de KAP-behandeling beïnvloed werden door de maturiteit en de complexiteit van de biofilmen. Om die reden moet men dan ook voorzichtig omspringen met het extrapoleren van resultaten bekomen na KAP-behandeling van single-species biofilmen naar meer complexe en meer mature biofilmen. Voor industriële toepassingen betekent dit bovendien dat de tijd tussen twee opeenvolgende reinigingscycli (gebruikmakende van KAP) zo kort mogelijk moet gehouden worden.

Aangezien de detectielimiet (zijnde ± 1.0 log10(CFU/cm²)) niet bereikt kon worden door middel van een individuele KAP-behandeling werd er onderzocht of een gecombineerde behandeling tot een (bijna) volledige inactivatie van de biofilmen zou kunnen leiden. De single-species biofilmen werden daarom behandeld met H2O2 (10 min - 0.05 of 0.20% (v/v)) en KAP (10 min - DBD - helium - 21.88 V). Er werd voor H2O2 gekozen omdat deze antimicrobiële component algemeen aanzien wordt als veilig en omdat voorafgaande onderzoeken aantoonden dat H2O2 schade kan veroorzaken aan DNA, eiwitten, vetten en celmembranen. Er werd eveneens achterhaald of er een optimale behandelingsvolgorde bestaat, namelijk of de hoogste log-reductiewaarden konden bekomen worden wanneer (i) de KAP-behandeling werd gevolgd door de chemische behandeling met H2O2, (ii) de H2O2 behandeling werd gevolgd door de KAP-behandeling of (iii) de biofilmen gelijktijdig met KAP en H2O2 werden behandeld. Daarnaast werd ook nog onderzocht of (het gebrek aan) een verhoogde gecombineerde efficiëntie gedeeltelijk het gevolg was van (i) het verwijderen van de biofilmen, (ii) de aanwezigheid van catalase in de biofilmen en/of (iii) de inductie van sub-lethal injury. Voornamelijk dit laatste aspect is van belang aangezien deze beschadigde cellen zowel meer als minder resistent kunnen worden ten opzichte van een volgende (aanvullende) behandelingsprocedure. De resultaten toonden aan dat sommige gecombineerde behandelingen resulteerden in een verhoogde gecombineerde efficiëntie terwijl voor andere combinaties net het tegenovergestelde werd vastgesteld. Een verhoogde efficiëntie was hoogstwaarschijnlijk het gevolg van een gedeeltelijke verwijdering van de biofilmen, de inductie van sub-lethal injury en/of een verandering van de porositeit van de biofilmen na de eerste individuele behandeling. Een verlaagde efficiëntie, die meestal vastgesteld werd bij een gelijktijdige behandelingsprocedure, werd anderzijds verklaard door middel van de aanwezigheid van catalase en de gelimiteerde diffusie van de (reactieve) plasmadeeltjes in de H2O2 oplossing. De detectielimiet werd uiteindelijk bereikt wanneer de optimale KAP-behandeling gevolgd werd door de chemische behandeling met de hoogste concentratie aan H2O2 (0.20% (v/v)). Er werd op basis hiervan geconcludeerd dat de implementatie van KAP in een volledig desinfectieproces kan resulteren in een (bijna) volledige inactivatie van (single-species) biofilmen aanwezig op abiotische oppervlakken.

Hoewel voorafgaande onderzoekslijnen uitwezen dat de optimale KAP-behandeling, al dan niet in combinatie met H2O2, kan leiden tot een sterke reductie van de celdichtheid van biofilmen werd er nagegaan of gelijkaardige log-reducties eveneens konden bekomen worden wanneer een alternatieve lucht-gebaseerde plasma set-up werd gebruikt. Dit is economisch voordeliger aangezien dit geen extra kosten met zich meebrengt voor de aankoop van gas(flessen). De modelbiofilmen werden hier behandeld met een SBD-elektrode die gebruik maakt van lucht als voedingsgas. De bekomen inactivatiedynamieken en -efficiëntie werden nadien vergeleken met deze die eerder werden bepaald gebruikmakende van de (optimale) KAP-behandeling (DBD/SBD - helium - 21.88 V). De resultaten toonden aan dat de efficiëntie van de behandeling eerder afhankelijk was van de elektrode dan van de samenstelling van het voedingsgas. De efficiëntie van de lucht-gebaseerde SBD-elektrode was gelijkaardig aan deze van de helium-gebaseerde SBD-elektrode terwijl de efficiëntie van de helium-gebaseerde DBD-elektrode groter was dan deze van de lucht-gebaseerde SBD-elektrode. Op basis hiervan werd dan ook geconcludeerd dat lucht zeker een waardig alternatief vormt voor helium, maar dat het gebruik van een DBD-elektrode sterk aangewezen is.

Tot slot werd er onderzocht op welke manier de (plasmabehandelings)condities een invloed hadden op het inactivatiemechanisme van KAP voor biofilmen. Er werd daarom voor elke mogelijke combinatie van de eerder geselecteerde condities nagegaan of de cellen die aanwezig waren in de single-species biofilmen geïnactiveerd werden door (i) de gevormde UV fotonen, (ii) de aanwezigheid van reactieve zuurstof en stikstofdeeltjes (RZD en RSD) en/of (iii) een daling van de pH. Daarnaast werd er ook onderzocht of de inactivatie van de cellen gelinkt kon worden aan membraanschade en/of schade toegebracht aan het intracellulaire DNA. Door zowel de L. monocytogenes (Gram positief) en S. Typhimurium (Gram negatief) single-species biofilmen te behandelen was het eveneens mogelijk om na te gaan of het Gram type van de cellen een invloed heeft op het KAP-inactivatiemechanisme. De resultaten van deze onderzoekslijn gaven aan dat de vorming van de KAP-deeltjes inderdaad beïnvloed werd door de toegepaste (plasmabehandelings)condities en dat het dodelijke effect van KAP het resultaat was van zowel schade aan het membraan als aan het DNA van de cellen. De schade aan het membraan bleek echter een grotere bijdrage te hebben. Tot slot kon ook vastgesteld worden dat het Gram type van de cellen geen grote invloed bleek te hebben op het inactivatiemechanisme. Deze toegenomen kennis met betrekking tot het inactivatiemechanisme van KAP voor biofilmen is cruciaal voor de verdere optimalisatie van deze technologie voor desinfectie van oppervlakken.