Xeno-nucleïnezuurpolymerasen door gerichte evolutie.

Artificiële nucleïnezuren of xenonucleïnezuren (XNA) bieden een mogelijk alternatief voor hun natuurlijke tegenhangers dankzij een grotere chemische diversiteit en hogere chemische en biologische stabiliteit, en hebben potentiële toepassingen als bijvoorbeeld therapeutica. XNA kan verschillen van DNA en RNA door modificaties aan de nucleobasen, de suiker-fosfaatruggengraat, de uittredende groep van het nucleotide, of een combinatie hiervan. In de toekomst zou XNA aan de basis kunnen liggen van een orthogonaal genetisch systeem, dat “onzichtbaar” is voor de natuurlijke wereld en zich onafhankelijk kan repliceren door chemische en enzymatische ontkoppeling. Van groot belang voor de ontwikkeling en manipulatie van XNA zijn geschikte polymerasen, die op basis van een template synthetische nucleotiden kunnen toevoegen aan een groeiende XNA-keten. Deze polymerasen kunnen gecreëerd worden door natuurlijke varianten te onderwerpen aan gerichte evolutie, een in vitro proces van mutagenese en selectie. In dit project schuiven we het DNA-polymerase van bacteriofaag phi29 naar voor als een nieuwe kandidaat voor de gerichte evolutie tot een XNA-polymerase. Replicatie bij bacteriofaag phi29 is een symmetrisch proces dat geïnitieerd wordt vanaf een proteïneprimer, wat de ontwikkeling van een eenvoudig in vivo XNA-episoom mogelijk moet maken. De keuze voor dit enzym wordt ondersteund door het feit dat phi29 DNA-polymerase promiscue incorporatieactiviteit vertoont voor suiker-gemodificeerde nucleotiden. Een aantal mutantenbibliotheken werd ontworpen en geconstrueerd, gebaseerd op structurele informatie van het polymerase om de kans op interessante varianten te vergroten. Het polymerase werd met succes tot display gebracht op faag in zijn actieve vorm. Een nieuw faagdisplaysysteem gebaseerd op co-display van polymerase en HaloTag werd ontwikkeld om aanhechting van een primer-templatecomplex aan de faag te vereenvoudigen, en selectie voor incorporatie van gemodificeerde nucleotiden mogelijk te maken. Het voorgestelde co-displaysysteem kan in principe ook gebruikt worden voor de evolutie van andere types van enzymen. Uit preliminaire selectie-experimenten blijkt dat de kwaliteit van de bibliotheken, nauwkeurige controle over de groeicondities en proteïne-expressie, en optimale selectieprocedures uiterst belangrijk zijn om succesvolle aanrijking te bekomen. Verdere verfijning van de selectiecondities is nodig voor de isolatie van functionele XNA-polymerasen, die een eerste stap vormen voor de ontwikkeling van een orthogonaal XNA-episoom.