TBC

De 43-kDa connexin (Cx43) isovorm komt tot expressie in verschillende celtypes en weefsels en is een van de belangrijkste bouwstenen voor het vormen van “gap junctions” en hemikanalen in het hart, de hersenen en het bot. “Gap junctions” verbinden het cytoplasma van twee naburige cellen, waardoor signaalmoleculen, ionen en metabolieten worden uitgewisseld, terwijl hemikanalen paracriene signaaloverdracht mogelijk maken door het vrijlaten van ATP en andere signaalmoleculen in de extracellulaire omgeving. De opening van Cx43 hemikanalen moet strikt gecontroleerd worden om verlies van metabolische, energetische en ionische gradiënten te vermijden, wat zou resulteren in celtoxciteit en celdood.

De regulatie van Cx43-gebaseerde “gap junctions” is reeds uitgebreid bestudeerd in het verleden, waarbij bleek dat de activiteit van Cx43 “gap junctions” gecontroleerd wordt door intramoleculaire interacties tussen de C-terminale staart (CT) van Cx43 en het tweede deel van de intracellulaire lus (L2). Een "ball-and-chain" -model werd voorgesteld waarin binding van de CT-staart naar de L2-regio resulteert in het sluiten van de Cx43-gebaseerde “gap junctions”. Tot voor kort bleven de mechanismen die de Cx43-hemikanaalactiviteit controleren onopgehelderd. Ons laboratorium heeft echter gevonden dat er in Cx43 hemiakanaln soortgelijke lus/staart-interacties bestaan, zoals bij “gap junctions”, maar met een tegengesteld functioneel resultaat, waarbij lus/staart-interacties essentieel zijn voor de opening van Cx43-hemichannel. Verlies van lus/staart-interacties, hetzij door genetisch de CT van Cx43 te verwijderen of door fysiologische processen (zoals verhogingen in [Ca2+]i van 1 µM en hoger) die actomyosin-contractiliteit veroorzaken, resulteert in verlies van Cx43-hemichannelactiviteit. Dit kan worden overwonnen door de laatste 9 aminozuren van de CT (CT9), die de L2-regio als doelwit hebben, en meer specifiek de Gap19-regio binnen deze sequentie, in Cx43.

Ten eerste identificeerden we de aminozuren in de CT9-regio die verantwoordelijk zijn voor L2-interactie en voor het beïnvloeden van de Cx43-hemikanaalactiviteit. We vonden dat de interactie tussen CT9 en L2 kritisch afhangt van de aanwezigheid van de Asp378- en Asp379-aminozuren en van de Pro375- en Pro377-aminozuren. Het veranderen van deze aminozuren in TAT-CT9 (een celpermeabele variant van het CT9 peptide) in alanine’s neutraliseerde de werking van het peptide, waarbij het peptide niet meer in staat was de hemikanaalactiviteit van CT-getrunceerde Cx43 hemikanalen en van Cx43-hemikanalen die geinhibeerd werden door actomyosin-contractiliteit te herstellen. De unieke rol van negatief geladen aminozuren in de activiteit van CT9 correleert met vermoedelijk doel van CT9, namelijk de Gap19-regio, die bestaat uit een reeks van positief geladen aminozuren.

Ten tweede, ondanks het feit dat alleen de laatste 9 aminozuren voldoende waren om de activiteit van Cx43 hemikanlen waarbij de volledige CT ontbrak te herstellen, heeft de verwijdering van deze aminozuren in de CT slechts een beperkte impact op de interactie van de CT met Gap19/L2 regio. Op basis van deze bevindingen, postuleerden wij dat een andere regio binnen de CT bijdraagt tot de interactie met Gap19/L2 regio. Hier hebben we het SH3-bindende domein geïdentificeerd als een tweede regio binnen de CT die deelneemt aan loop/staart interacties. TAT-SH3 peptide (een celpermeabel peptide gekoppeld aan het SH3-bindingsdomein) was in staat om de activiteit van Cx43 kanalen zonder CT of van Cx43 kanalen geinhibeerd door het actomyosin cytoskelet te herstellen. Bovendien was het vermogen van TAT-SH3 om de activiteit van Cx43 hemikanalen zonder CT te herstellen afhankelijk van de aanwezigheid van de Gap19 regio, aangezien de verwijdering van deze regio zorgde dat deze kanalen ongevoelig werden voor functionele modulatie door TAT-SH3. Verwijdering van hetzij het SH3-bindende domein of het CT9-domein in Cx43 verminderde hemichannelactiviteit, terwijl de verwijdering van beide domeinen de Cx43-hemichannelactiviteit volledig afgeschaft.

Ten derde weten we dat de CT van Cx43 niet alleen belangrijk is voor kanaalregulering, maar ook belangrijk voor de degradatie van Cx43. Hier hebben we de bijdrage van autofagie, een lysosomale afbraakmechanisme, nagegaan voor Cx43-hemikanaal “turn-over” door cellen bloot te stellen aan een tekort aan nutriënten, een behandeling waarvan geweten is dat ze autofagie uitlokt. Uit onze gegevens blijkt dat een tekort aan nutrienten in het medium leidt tot een snelle daling van de Cx43-eiwitgehalten, zowel als “gap junctions” en hemikanalen. Bovendien, een autofagie-remmer die inwerkt ter hoogte van de lysosomen, zoals Bafilomycin A1, kan de eiwitniveau’s van Cx43 alsook de werking van Cx43 als hemikanaal gedeeltelijk herstellen.

Samenvattend, in deze studie (i) werden de kritische aminozuren in de CT9 regio, die verantwoordelijk zijn voor de functionele modulatie van Cx43-hemikanalen, geïdentificeerd; (ii) werd het SH3-bindende domein als een nieuwe determinant bij lus/staart-interacties geïdentificeerd en werd aangetoond dat deze regio belangrijk is voor de werking van Cx43-hemikanalen; en (iii) werd het autofagie proces geïdentificeerd als een belangrijk mechanisme betrokken bij de degradatie van Cx43 hemikanalen, in het bijzonder wanneer er een tekort is aan nutriënten.