Synthese en toepassing van probes voor serine en cysteine hydrolasen en het polyamine transport systeem

Activity-based probes (ABPs) zijn moleculaire gereedschappen die covalent binden aan de actieve site van enzymen. Met behulp van deze gereedschappen kan enzymatische activiteit worden gedetecteerd en gemonitord. ABPs bestaan uit drie delen: een “warhead”, die bindt met het enzym; een herkenningselement, waarmee de selectiviteit van een probe kan worden beïnvloed; en een detectielabel, waarmee probe-gelabelde enzymen kunnen worden gevisualiseerd, gekwantificeerd of opgezuiverd. ABPs worden toegepast om de functie of lokalisatie van enzymen te bepalen. Ze kunnen verder ook gebruikt worden om de rol van enzymen in ziektebeelden te bepalen of bij de screening van potentiële geneesmiddelkandidaten.

Om de activiteit van een enkel enzym te monitoren moet de selectiviteit van een ABP gestuurd woden naar dit ene doelwit. Hiervoor is een synthetisch proces nodig dat in de meeste gevallen erg tijdrovend is. D aarom zijn er slechts relatief weinig selectieve ABPs ontwikkeld voor enzymen die tot expressie worden gebracht in menselijke cellen. Een enzymenfamilie waarvan slechts enkele enzymen selectieve ABPs hebben zijn de serine hydrolasen. Om het proces van ABP-ontwikkeling voor serine hydrolasen te versnellen, werden vaste-fasesynthese procedures ontwikkeld in Hoofdstuk III, waarmee zes types van serine-reactieve probes kunnen worden gemaakt. Met behulp van deze procedures werd een combinatorische bibliotheek gemaakt van ABPs die een herkenningselement bevatten met een aromatische groep en een piperidine/piperazinering, en een serine-reactieve warhead. Van twee probes van deze bibliotheek met een triazoolurea warhead werd gevonden dat ze reactief en selectief zijn voor acyl-proteine thioesterases 1 en 2 (APT-1/2) in een screening op de serine hydrolasen die aanwezig zijn in een muizenbrein.

In Hoofdstuk IV worden de procedures die ontwikkeld werden in Hoofdstuk III gebruikt om een bibliotheek van ABPs te maken met een triazoolurea warhead, gebaseerd op de APT-1/2-reactieve probes die ontwikkeld werden in het vorige hoofdstuk. In deze nieuwe bibliotheek werden er veranderingen aangebracht in de herkenningselementen van de probes om hun reactiviteit en selectiviteit voor de APT-isovormen te proberen sturen. Deze bibliotheek leverde geen isovorm-selectieve probes op, maar er werden wel verschillende probes gevonden met een hogere activiteit voor de beide APT-isovormen dan de originele probes.

Hoofdstuk V beschrijft de ontwikkeling van ABPs voor het SARS-CoV-2 main protease (Mpro). Mpro is een cysteine protease dat een sleutelrol speelt in de proteolytische maturatie van de niet-structurele eiwitten van het SARS-CoV-2 virus door het klieven van de polyproteinen die tot expressie worden gebracht door het virus. Mpro is daarom een belangrijk potentieel doelwit voor de ontwikkeling van antivirale geneesmiddelen voor de behandeling van Covid-19. In dit hoofdstuk worden azapeptidische ABPs ontwikkeld die reageren met het SARS-CoV-2 Mpro. Het herkenningselement van dez probes bestaat uit de P1-, P2- en P3-voorkeurssubstraten van Mpro, waarvan het P1-substraat een aza-aminozuur is. De ABPs zijn gecapped op het P1 aza-aminozuur met een cysteine-reactieve groep. Van een ABP met een chloroacetamide warhead werd gevonden dat deze erg potent reageert met Mpro en een lage detectielimiet heeft voor probe-labeling. Deze ABP kon ook celdood verhinderen in cellen die besmet zijn met SARS-CoV-2 en kan potentieel gebruikt worden voor het labelen van Mpro in levende cellen.

Hoofdstuk VI behandelt de ontwikkeling van fluorescente polyamine probes. Aan het begin van dit onderzoeksproject was het polyamine transport in zoogdieren een mysterie, daar er nog geen eiwitten waren geïdentificeerd als zijnde polyamine transporters. In dit hoofdstuk werden polyamines ontwikkeld die gefunctionaliseerd werden met azides, waarmee via “click” chemie met alkyn-gefunctionaliseerde BODIPY fluoroforen fluorescente polyamineprobes werden gemaakt. Deze polyamineprobes hebben verschillende lengtes, een verschillende positionering van het fluorofoor ten opzichte van het polyamine en een verschillend aantal positieve ladingen. Er werd gevonden dat polyamine probes waarbij de fluorofoor verbonden is aan een van de buitenste amines van het polyamine beter opgenomen wordt dan probes waarbij de fluorofoor aan een van de middelste amines zit. Deze lineaire probes zijn sindsdien gebruikt door andere onderzoeksgroepen om moleculaire spelers in polyamine transport te identificeren.

Samengevat beschrijft deze thesis de synthese en toepassing van probes die als doelwit APT-1/2, SARS-CoV-2 Mpro of het polyamine transport systeem hebben. Deze probes werden op efficiënte manieren gesynthetiseerd door vaste-fasesynthese of click chemie. De ontwikkelde vaste-fasesyntheseprocedures kunnen ook gebruikt worden voor de ontwikkeling van probes die andere serine of cysteïne hydrolasen als doelwit hebben.