Ontwikkeling van een generiek screeningsplatform voor metabolic engineering toegepast op de selectie van een optimale sialic acid producer

Onder invloed van ecologische bezorgdheden en de beperkte hoeveelheid fossiele brandstoffen gebruikt de chemische industrie meer en meer microbiële technologie voor de economisch rendabele productie van diverse moleculen uit hernieuwbare bronnen. Verschillende van dergelijke metabolic engineering strategieën worden ondersteund door technieken uit de synthische biologie wat de ontwikkeling van nieuwe microbiële celfabrieken voor een bepaalde molecule mogelijk maakt.

Eén van dergelijke interessante moleculen is N-acetylneuraminezuur, een suikermolcule met een essentiële rol in verschillende fysiologische processen zoals tumor groei, bacteriële infecties, hersenontwikkeling en immuniteit, waardoor het diverse toepassingen heeft in de farmaceutische en de voedingsindustrie. De ontwikkeling van deze toepassingen wordt echter verhinderd door de beperkte beschikbaarheid van N-acetylneuraminezuur wat een gevolg is van een tekort aan afdoende productie technologieën. Deze beperking kan worden opgeheven door gebruik te maken van metabolic engineering wat toelaat om het metabolisme ad hoc aan te passen om zo een organisme te bekomen met een geoptimaliseerde biosynthetische pathway met een maximale productiviteit. Dergelijke optimalisatie is echter een arbeidsintensief proces dat verschillende technieken vereist om gen expressie aan te passen, genetische ciruits te bouwen en specifieke moleculen te detecteren in de cel. Hierdoor was het hoofddoelstelling van dit doctoraatsonderzoek de ontwikkeling van verschillende ondersteunde technologieën voor metabolic engineering welke toelaten om genetische circuits te bouwen en kleine moleculen te detecteren. De laatste jaren heeft de programmeerbaarheid van RNA de ontwikkeling van diverse nieuwe riboregulator gebaseerde technieken gestimuleerd. Deze technologie wordt meer en meer gebruikt in metabolic engineering om de productiviteit te maximaliseren. Eén interessant type van RNA regulatoren zijn riboregulatoren, welke toelaten om translatie te controleren zonder de nood voor coexpressie van stress veroorzakende eiwitten. De ontwikkeling van deze riboregulatoren wordt echter gehinderd door een gebrek aan duidelijke design regels, wat de toepasbaarheid in metabolic engineering beperkt. Om dit probleem op te lossen werden zo genaamde tiRNAs ontwikkeld. Deze riboregulatoren laten toe om controleerbaar eiwitexpressie op het translationele niveau te regelen. Deze tiRNA moleculen werden ontwikkeld via een systematische zoektocht door mogelijk interessante eigenschappen via een experimenteel design. Deze de novo ontwikkelde riboregulatoren onderdrukken translatie tot 6% van de originele eiwitexpressieniveaus, wat een verbetering is van de dynamisch gebied van dergelijke riboregulatoren die vroeger werden beschreven. In contrast met deze vorige studies, zijn de tiRNA regulatoren volledig van niets ontworpen en ze dus geen natuurlijk voorkomend chassis nodig hebben om te functioneren. Om de eigenschappen van de tiRNA riboregulatoren te linken aan hun efficiëntie werd een PLS model ontwikkeld, wat de programmeerbaarheid van deze riboregulatoren verder uitbereidt. Naast aanpassingen van gen expressie laat RNA technologie ook toe om gen expressie te regelen op basis van de aanwezigheid van kleine moleculen. De laatste jaren zijn dergelijke RNA tools die reageren op kleine moleculen, meer specifiek riboswitches, gebruikt in verschillende metabolic engineering strategieën als alternatief voor hun traditionele eiwittegenhangers. Echter, de ontwikkeling van riboswitches op basis van in vitro geselecteerde aptameren vereist typisch arbeidsintensieve screening, wat hun toepasbaarheid sterk limiteert. Om deze hinderpaal in metabolic engineering te verwijderen werd een computationeel design algoritme ontwikkeld wat toelaat om in silico te screenen voor riboswitches. Om de riboswitch capaciteiten van een UTR te kwantificeren werd een doelfunctie opgesteld op basis van vroeger beschreven riboswitches. Gebruik makend van deze doelfunctie werden 29 potentiële riboswitches computationeel ontworpen gebruik makend van een zoekalgoritme. Vervolgens werden deze riboswitches in vivo geëvalueerd, waaruit bleek dat 12 van de 29 ontwikkelde riboswitches een activatie ratio hadden van meer dan vijf. Echter, ondanks de hoge waarschijnlijkheid om werkende riboswitches te ontwerpen, was het onmogelijk om de riboswitch functionaliteit te linken aan structurele of thermodynamische eigenschappen. Het ontwikkelde algoritme kan helpen om de ontwikkelingstijden te verkorten van translationele riboswitches, wat hun toepasbaarheid kan vergroten. De complexe natuurlijke regulatie van het microbiële metabolisme laat toe om verschillende metabolic engineering strategieën te ontwikkelen, welke dikwijls intracellulaire detectie van specifieke moleculen vereisen. Om dit te bekomen werden verschillende biosensoren ontwikkeld gebaseerd op natuurlijk voorkomende transcriptiefactoren, wat typisch de mogelijkheden tot ad hoc optimalisatie van de responsecurve beperkt. Als een proof of concept werden er verschillende nieuwe biosensoren voor de detectie van N-acetylneuraminezuur, gebaseerd op natieve of aangepaste transcriptionele promotoren die interageren met de transcriptiefactor NanR. Vervolgens werden deze ontwikkelde biosensoren geëvalueerd gebruik makende van een N-acetylneuraminezuur producerende stam. Om de ontwikkelde biosensoren op een modulaire manier te optimaliseren werd een NanR binding site in een constitutieve promoter geplaatst, wat resulteerde in biosensoren die uit verschillende gedefinieerde onderdelen bestaan. Dergelijke manier van biosensoren ontwikkeling laat toe om op een meer betrouwbare manier de responsecurve aan te passen, wat de toepassingsmogelijkheden van biosensoren in metabolic engineering verder vergroot. De vergrote mogelijkheden om de responsecurve aan te passen werden aangetoond door de response van één van de ontwikkelde biosensoren aan te passen via het vervangen van de ribosoom binding site die instaat voor de translatie initiatie van NanR. Daarnaast werden drie biosensoren gecombineerd met verschillende productieniveaus van N-acetylneuraminezuur (tot 1.4 ¡À 0.4 g/L extracellulair) waarbij werd aangetoond dat de waargenomen fluorescentie evenredig was met het productieniveau. Dit toont aan dat de biosensoren een brede operationele regio bevatten, een belangrijke eigenschap van biosensoren waardoor ze verschillende toepassingen hebben in metabolic engineering. Algemeen werd het aantal beschikbare biosensoren uitgebreid met verschillende functionele biosensoren die intracellulair Nacetylneuraminezuur kunnen meten, waardoor ze kunnen helpen bij diverse metabolic engineering strategieën om een maximale productie te bereiken. Algemeen werden er in dit doctoraatsonderzoek verschillende technieken ontwikkeld die een meer betrouwbare optimalisatie van microbiële celfabrieken toe laten. Meer specifiek werden de mogelijkheden verbeterd om translatie inhiberende riboregulatoren en translationele riboswitches te ontwerpen, wat de toepasbaarheid van verschillende technieken uit de RNA synthetische biologie vergroot. Daarnaast werden verschillende technieken gebruikt om modulaire biosensoren met vergrootte engineering mogelijkheden te ontwikkelen. Bovendien werden biosensoren voor N-acetylneuraminezuur ontwikkeld die de vereiste eigenschappen bevatten die toelaten om verschillende nieuwe metabolic engineering strategieën toe te passen die vroeger onmogelijk waren.