Identificatie en karakterisatie van de kankerstamcel in multipel myeloom. (FWOKN215)

De hypothese van het kankerstamcelmodel is dat niet alle tumorcellen, maar enkel een kleine subpopulatie van de tumorcellen, de kankerstamcel, in staat is om nieuwe tumoren te vormen. Alternatieve termen voor de kankerstamcel is de tumor-initiërende of tumorigene cel. Belangrijke eigenschappen van de kankerstamcel is dat deze zich kan vernieuwen en alle heterogene celtypes van de tumor kan vormen. Het kankerstamcelmodel heeft grote implicaties voor therapie. Er wordt gesuggereerd dat de conventionele therapieën de grote massa van de tumor elimineren, maar niet de kankerstamcel en dit zal dan uiteindelijk leiden tot het terug uitgroeien van de tumor en herval van de patiënt (1). Het eerste bewijs van kankerstamcellen werd aangetoond in de hematologische kanker acute myeloïde leukemie. Er werd aangetoond dat enkel de subpopulatie die de oppervlaktemerker CD34 uitdrukken, maar niet CD38 in staat is om in NOD/SCID muizen tumor te initiëren (2). Ook in solide tumoren, zoals kanker van borst en hersenen, werden kankerstamcellen geïdentificeerd (3, 4). Multipel myeloom (MM) is een hematologische kanker gekarakteriseerd door de accumulatie van kwaadaardige plasmacellen in het beenmerg, die monoklonale antilichamen produceren. De interactie van de beenmerg micro-omgeving met de tumorcellen stimuleert de productie van groeifactoren, angiogene en osteoclast-activerende factoren, resulterend in tumorgroei, angiogenese of de aanmaak van nieuwe bloedvaten en osteolyse leidend tot botziekte (5). De massa van de tumor in het beenmerg bestaat uit gedifferentieerde plasmacellen met als oppervlaktemerker CD138. Er zijn suggesties dat er een B-celpopulatie aanwezig is in het beenmerg en bloed van MM patiënten met dezelfde immuunglobuline gensequentie als de MM plasmacel (6, 7, 8). De rol van deze B-cellen in de pathogenese van MM is onduidelijk, maar recent werd aangetoond dat er een CD138 negatieve subpopulatie aanwezig is in het beenmerg die, in tegenstelling tot de CD138+ tumorcellen, clonogeen en tumorigeen is, in vitro in de clonogene assay en in vivo in NOD/SCID muizen. Deze CD138- cellen drukken de oppervlaktemerkers CD19 en CD20 uit, opnieuw suggererend dat de MM stamcel (MMSC) een B-cel is (9). Het doel van het huidige project is de identificatie en karakterisatie van de MMSC in 5TMM modellen. Deze modellen zijn origineel ontstaan door de spontane ontwikkeling van MM in oude C57BL/KaLwRij muizen met een incidentie van 0.5% (10). MM werd verdergezet door intraveneuze injectie van de beenmergcellen van de zieke muizen in jonge, immuuncompetente en syngene muizen. Op deze wijze ontstonden er verschillende modellen die verscheidene varianten van de ziekte vertegenwoordigen. In ons labo zijn er 2 5TMM modellen aanwezig: het 5T2MM en 5T33MM model. Het 5T2MM model wordt gekarakteriseerd door een langzame groei van de tumor in het beenmerg en de botten vertonen kenmerken van MM botziekte (osteolytische lesies, verminderd trabeculair volume, verhoogde aanwezigheid van osteoclasten). Het 5T33MM model wordt gekarakteriseerd door een snelle groei van de tumor in het beenmerg, maar de muizen vertonen geen MM botziekte (11). In beide modellen werd angiogenese aangetoond in het beenmerg (12). Er werden monoclonale antilichamen gegenereerd die het specifiek idiotype van de 5T2MM en 5T33MM cellen herkennen (13). Het eerste deel van het project bestaat uit de identificatie van de MMSC in de 5TMM modellen waarbij 2 strategieën zullen worden gevolgd. Enerzijds zal de CD138- populatie worden onderzocht volgens de data van Matsui et al. (9) met als meerwaarde het 5TMM model dat syngeen en immuuncompetent is ten opzichte van NOD/SCID muizen. In het 5T2MM model werd reeds beschreven dat er een CD138- populatie aanwezig is en uit preliminaire experimenten blijkt dat ook in het 5T33MM model CD138- tumorcellen aanwezig zijn (14). Een 2de strategie die zal worden gevolgd is in samenwerking met de internationale partners van het MSCNET project (zie "Situering onderzoek"). Verschillende groepen trachten simultaan de MMSC populatie te identificeren en isoleren vertrekkende van humane stalen op basis van oppervlaktemerkers (multiparametrische flow cytometrie) en met moleculaire technieken. Vervolgens zal op basis van deze resultaten worden onderzocht of er een gelijkaardige MMSC aanwezig is in de 5TMM modellen die kan worden gesorteerd gebruik makend van MACS (magnetic activated cell sorting) en/of FACS (fluorescent activated cell sorting). Voor de celpopulaties verkregen met beide strategieën zal de clonogene capaciteit (in vitro clonogene assay) van de geïsoleerde MMSC worden nagegaan en vervolgens zal de populatie worden ingespoten in jonge syngene muizen om de tumorigene capaciteit te onderzoeken. De ontwikkeling en karakteristieken van MM ziekte zal worden geanalyseerd door het bepalen van de plasmocytose in het beenmerg (cytospins gekleurd met May-Grünwald-Giemsa), de aanwezigheid van paraproteïne in het serum (electroforese), angiogenese (CD31 immunokleuring op beenmergcoupes, in samenwerking met Dr. De Raeve, Pathologie, UZ Brussel) en botziekte (osteolytische lesies, botdensiteit, trabeculair volume en aantal TRAP positieve osteoclasten, in samenwerking met Dr. Croucher, University Sheffield, UK). Een belangrijk kenmerk van de kankerstamcel is dat deze populatie in staat is om alle heterogene celtypes van de tumor te vormen. Het fenotype van de tumorcellen in het beenmerg van muizen ingespoten met de MMSC zal worden nagegaan met flow cytometrie en vergeleken met tumorcellen van muizen ingespoten met de totale, niet gesorteerde populatie. Er is nog niet veel geweten over de MMSC, dus een betere karakterisatie is nodig om de kennis van de pathofysiologie van MM uit te breiden en om nieuwe therapeutische doelwitten te kunnen identificeren. Een uitgebreide karakterisatie zal worden gedaan door het genexpressieprofiel van de MMSC te bepalen en vergelijken met de niet-MMSC (Affymetrix, genoom overspannende mouse gene1.0 array, in samenwerking met Prof. Schuit, KUL). Niet enkel de genetische karakterisatie is belangrijk, maar ook de proteïnen die betrokken zijn in signaalwegen voor de proliferatie en overleving van MM cellen, kunnen veel informatie geven. Er bestaat een array die de fosforylatie van een groot aantal verschillende kinase substraten kan detecteren (PepChips). Het kinoom van de MMSC zal worden vergeleken met de niet-MMSC. Dit is een onderdeel van het MSCNET programma en deze experimenten zullen in samenwerking worden uitgevoerd met Dr. Bos (University Medical Center, Groningen, Nederland). In MM zijn de tumorcellen gelokaliseerd in het beenmerg is en dat is deels te wijten aan een specifieke homing van de tumorcellen naar het beenmerg waar ze dan de juiste niche vinden om te groeien. De homingscapaciteiten van de MMSC naar het beenmerg en de lokalisatie van deze cellen in het beenmerg zullen worden geanalyseerd. De homing wordt gekwantificeerd door radioactief gemerkte MM cellen in te spuiten en na 18 uur de recovery in het beenmerg te meten (15). Voor de lokalisatie van de stamcel tov. de verschillende celtypes in de beenmerg micro-omgeving zijn er verschillende opties om de tumorcellen te detecteren. Er kan worden gebruik gemaakt van de anti-idiotype antilichamen (op voorwaarde dat het idiotype wordt uitgedrukt door de MMSC), de tumorcellen kunnen worden gemerkt met een fluorescente probe vooraleer in te spuiten of de cellen kunnen worden getransduceerd met een lentivirale vector die green fluorescent protein (GFP) bevat (gevolgd door detectie met ofwel fluorescentie of confocale microscopie ofwel immunokleuring tegen GFP en evaluatie met lichtmicroscopie). Een belangrijk kenmerk van de kankerstamcel is resistentie tegen de gebruikte geneesmiddelen dat te wijten zou kunnen zijn aan de expressie van ABC transporters en het "quiescent" zijn van de stamcel (16). Ook in MM werd aangetoond dat de CD138- MMSC populatie resistent is tegen klinisch actieve stoffen (17). De proliferatie en celcylcus eigenschappen en de expressie van ABC transporters van de MMSC zullen worden nagegaan en vergeleken met de niet-stamcel populatie. Met 3H-thymidine incorporatie assays zal worden nagegaan wat het effect is van de klinisch meest relevante drugs (melphalan, dexamethasone, thalidomide, bortezomib) op de DNA synthese van de MMSC en de niet-MMSC. Vorig onderzoek in ons labo toonde aan dat de behandeling van 5TMM zieke muizen met de IGF-1receptor inhibitor, picropodophyllin (PPP) resulteerde in een drastische vermindering van tumorload, angiogenese en botlesies en een verlenging van overleving (18, 19). Bovendien zijn er ook ongepubliceerde data van onze groep die aantonen dat de bulk van 5TMM cellen gevoelig zijn aan methylatie (5'aza-2'-deoxycytidine) en HDAC (LBH589) inhibitoren. De effecten van deze producten op de MMSC zullen worden nagegaan. In MM werd aangetoond dat de beenmerg micro-omgeving zowel adhesiemoleculen uitdrukt als humorale factoren secreteert welke de overleving en groei van MM cellen bevordert. Een aantal groeifactoren werden beschreven met als belangrijkste interleukine-6 (IL-6) en insulin-like growth factor-1 (IGF-1). De MM cellen drukken receptoren uit voor deze groeifactoren (20, 21). We willen nagaan of de beenmerg stromale cellen enerzijds en deze groeifactoren (IL-6 en IGF-1) anderzijds ook belangrijk zijn voor de MMSC. Hiervoor gaan we de expressie van deze receptoren meten met flow cytometrie op de MMSC en niet-MMSC en het effect van de stromale cellen en van IL-6 en IGF-1 op de proliferatie van de 2 celpopulaties bepalen. Signaaltransductiewegen zoals Notch en hedgehog reguleren zelfvernieuwing en zouden belangrijk zijn in normale stamcellen en kankerstamcellen (1). Peacock et al. (22) heeft beschreven dat de hedgehog pathway betrokken is in het onderhouden van de CD138- MMSC populatie. We zullen deze bevindingen trachten te bevestigen in ons systeem. Er is niets geweten over de Notch pathway. In ons labo is er al enige expertise in de Notch pathway en met real-time PCR zal de expressie van Notchreceptoren (Notch1, 2, 3, 4), liganden (dll1, 3, 4, jagged-1, -2) en doelwitgenen (Hes1, 5, HeyL, Hey1, 2) worden bepaald in de MMSC en niet-MMSC. Afhankelijk van de resultaten zullen we op eiwitniveau bevestigen door western blotting.

Trefwoorden:Stem Cell, Blood, Coagulation, Myeloma, Immunology, Microbiology, HLA, Hematology, Lymphoma, cancer, Bone Marrow Transplantation

Disciplines:Basiswetenschappen, Biologische wetenschappen