Een ingenieursbenadering berustend op in vitro en in silico modellering die ontwerp van olie-in-water-gebaseerde levensmiddelen op het vlak van vetvertering mogelijk kan maken

De vertering van lipiden in het menselijk lichaam heeft verschillende gezondheid en nutritionele gevolgen. Enerzijds zorgt een evenwichtige inname van lipiden voor energie en essentiële vetzuren. Anderzijds verhoogt een te hoge consumptie van lipiden het risico op het ontwikkelen van metabole ziekten zoals obesitas, diabetes of hart- en vaatziekten. Daarnaast zouden lipiden gebaseerde producten gebruikt kunnen worden als leveringssystemen voor lipofiele functionele componenten of als controlestrategie voor voedselinname. Alle laatstgenoemde functies zijn afhankelijk van het lipidenverteringsproces dat plaatsvindt in het maagdarmkanaal.

Lipidenvertering is een interfasefenomeen, dit betekent dat het in water oplosbare lipase eerst moet adsorberen aan het olie-wateroppervlak vooraleer enzymatische omzettingen kunnen starten. Daardoor zijn lipiden georganiseerd als colloïdale structuren, voornamelijk olie-in-water (o/w) emulsies, die gevormd kunnen worden tijdens voedselproductie of de spijsvertering. Vanuit het oogpunt van voedselontwerp hebben verschillende in vitro onderzoeken aangetoond dat de kinetiek van de lipidenvertering beïnvloed kan worden door de emulsie eigenschappen. De meeste van deze onderzoeken gebruikten echter geen fysiologisch relevant maaglipase om de lipolyse in dat compartiment te simuleren. Sommigen van deze onderzoeken hebben ook alleen de mate van lipidenvertering gemeten aan het einde van een verteringsstap. Een ander onderzoekshiaat heeft betrekking op de kwantificering van lipolyseproducten in studies die de nutritionele functionaliteit van emulsies evalueren. In het verleden kwantificeerden nutritionisten en voedingswetenschappers lipolyseproducten voornamelijk met behulp van de pH-stat-techniek. Deze techniek is echter niet specifiek voor de verschillende lipidenverteringsproducten gevormd tijdens de spijsvertering. Slechts een aantal studies analyseerden meerdere lipidenverteringsproducten. Bovendien hebben een beperkt aantal studies geavanceerde statistische technieken aangewend om het lipolysegedrag van emulsies te beschrijven of om het mechanisme voor lipidenvertering op te helderen.

Om de eerder uiteengezette redenen, richtte dit doctoraatswerk zich op (i) het evalueren van de gastro-intestinale lipolysekinetiek zoals beïnvloed door de o/w emulsiedruppelgrootte en interfasesamenstelling, en (ii) het verhelderen van het moleculaire mechanisme van lipolyse. Om deze onderzoeksdoelstellingen te bereiken, werd een statische in vitro verteringsmethode gevolgd. Deze methode maakte gebruik van een relevante vervanging van menselijke maaglipase, namelijk maaglipase van konijnen. Meerdere lipidenverteringsproducten (trioleïne, sn-1,2/2,3-dioleïne; sn-1,3-dioleïne; sn-2-monooleïne; sn-1/3-monooleïne en oliezuur) werden gekwantificeerd in functie van digestietijd (kinetische benadering) met behulp van een hiervoor ontwikkelde HPLC-Charged aerosol detector (CAD) techniek. Single-response modellering werd gebruikt om het verteringsgedrag van de verschillende emulsies te vergelijken. Bovendien stelde de geavanceerde techniek van multi-responsmodellering ons in staat om mechanistische inzichten te verkrijgen in de lipolysefenomenen.

In dit onderzoek werd het in vitro lipolysegedrag van twee belangrijke onderling gerelateerde emulsieontwerpeigenschappen bestudeerd: oliedruppelgrootte en interfasesamenstelling (emulsies met enkelvoudige en gemengde emulgatoren). Hiervan werden emulsies geformuleerd met 5% (w/w) trioleïne, 0,00625-1% (w/w) emulgatoren van verschillende aard zoals natriumtaurodeoxycholaat (NaTDC), Tween 80 (TW80), sojalecithine (LEC), soja-eiwit isolaat (SPI) en citruspectine (CP). Deze emulsies werden onderworpen aan in vitro vertering van maag en dunne darm volgens het protocol van het internationale netwerk INFOGEST. De verteerde stalen, die in functie van de digestietijd werden genomen, werden gekarakteriseerd via hun oliedruppeleigenschappen (bepaling van druppelgrootte, visualisatie van de microstructuur en bepaling van druppellading) en het gehalte aan lipolyseproducten (HPLC-CAD). Gedetailleerde inzichten werden verkregen omtrent de lipolysekinetiek in de maag- en dunne darmfase door gebruik te maken van verschillende modelleringstechnieken.

De geëvalueerde niveaus van emulsie-eigenschappen resulteerden in een verschillende lipolysekinetiek in zowel de maag- als dunne darmfase. Zo werd het effect van oliedruppelgrootte op de lipidenvertering tijdens de in vitro maagfase bestudeerd via emulsies gestabiliseerd met NaTDC. Deze emulsies werden aangemaakt zodat verschillende initiële druppelgroottes verkregen werden (fijn: 0,58 µm; medium: 1,82 µm; en groot: 4,00 µm). In deze studie werd voor het eerst meerdere lipolyseproducten gekwantificeerd, waaronder dioleïne en monooleïne regioisomeren. Een omgekeerde relatie tussen de druppelgrootte en de initiële snelheid en uiteindelijke mate van lipolyse werd vastgesteld. Nadat inzicht in de rol van de oliedruppelgrootte op het verteringsgedrag werd verkregen, werd het effect van de interfasesamenstelling op in vitro lipolyse geanalyseerd. Emulsies gestabiliseerd met 1% (w/w) kleine oppervlakteactieve stoffen NaTDC, LEC en TW80, evenals 1% (w/w) biopolymeren SPI en CP, werden verteerd onder in vitro maag- en dunne darmcondities. In de maagfase bereikten de emulsies gestabiliseerd met een biopolymeer de hoogste mate en initiële snelheden van lipolyse in vergelijking met de emulsies gestabiliseerd door de kleine oppervlakteactieve stoffen, deze vertoonden namelijk verschillende mate van lipolyse. In de daaropvolgende dunne darmfase speelde de maagstabiliteit van de emulsies een dominante rol in de lipolysekinetiek, aangezien zelfs een lage mate van maaglipolyse lipidenvertering in de dunne darm leek te veroorzaken. Op basis van deze inzichten over fysieke stabiliteit en in vitro lipidenverteringsgedrag werden CP en TW80 geselecteerd om emulsies met een gemengde interfase (1% CP en TW80 0,00625-0,1%) te vormen en in vitro te verteren. In de maagfase onthulde de kinetische analyse dat de vertering van lipiden werd bepaald door de TW80-concentratie in de initiële emulsie: lagere TW80 concentraties leidden tot hogere snelheidsconstanten en mate van lipolyse. In de dunne darmfase werden alle emulsies volledig verteerd, en de snelheidsconstante hing af van de maagstabiliteit van de emulsie, zoals ook waargenomen werd voor de emulsies gestabiliseerd door enkelvoudige emulgatoren. De in vitro vertering van emulsies met een mengsel van emulgatoren (CP en TW80) in de maagfase genereerde een tussenhypothese over het competitieve adsorptiefenomeen dat mogelijk plaatsvindt. Deze hypothese werd getest door de in vitro digestie van enkelvoudige en gemengde interfases met behulp van een aangepaste pendant drop techniek. Hierbij was de kinetiek van interfasespanning sterk gecorreleerd met de lipolysekinetiek van de o/w emulsies. Bovendien bevestigden de interfasespanning- en interfasereologiemetingen dat competitieve adsorptie (bijv. orogenic displacement) een belangrijke rol speelde tijdens de lipolyse van emulsies gestabiliseerd door CP en/of TW80.

Bovendien maakte de kwantificering van meerdere lipolyseproducten, waaronder regio-isomeren van de tussenproducten, het mogelijk om het in vitro lipolysemechanisme in de maag- en dunne darmfase verder op te helderen. Een eerste bewijs van dit mechanistische inzicht werd verkregen via 2 datasets gegenereerd uit de in vitro maagdigestie van emulsies met verschillende druppelgroottes. Dit mechanistische model van in vitro maaglipolyse omvatte een reactieschema met enzymatische en isomerisatiereacties. Interessante resultaten van dit mechanistische inzicht zijn onder meer (i) er is een bepaalde activiteit van maaglipase voor de sn-2-positie van de glycerolruggengraat, desondanks de hogere activiteit voor de sn-1/3 positie, en (ii) er treed vetzuurmigratie op van de sn-2 naar de sn-1/3 posities (isomerisatie). Dit maaglipolysemechanisme werd daarna gevalideerd via 6 onafhankelijke datasets geproduceerd in een opvolgstudie. Deze 6 datasets werden geproduceerd bij een verschillende maag pH en lipaseactiviteit, wat de robuustheid van het mechanistische model bevestigt. Een ander mechanisch model werd verkregen uit slechts één dataset, maar dit keer tijdens de dunne darmfase die de activiteit van zowel maag- als pancreaslipase weerspiegelt. Dit mechanistische model vertegenwoordigt een update van een eerder reactieschema voorgesteld vanuit onze onderzoekseenheid. Enzymatische en isomerisatiereacties werden opgenomen in het uiteindelijke reactieschema. Lipase-activiteit over de drie posities van de glycerolgroep werd waargenomen. De splitsing van het vetzuur vanop de sn-2-positie kan een indicatie zijn voor een bepaalde mate van maaglipase-activiteit tijdens in vitro vertering van de dunne darm.

Dit doctoraatsonderzoek toonde aan dat het sturen van in vitro lipidenverteringskinetiek mogelijk was door de manipulatie van emulsieontwerpeigenschappen. Dit werk kan een startpunt zijn voor de productie van emulsie gebaseerde producten met specifieke nutritionele functionaliteiten. Bovendien leverde de combinatie van een geavanceerde kwantificeringsmethode van lipolyseproducten en de gebruikte statistische modelleringstechnieken een grondig inzicht in het moleculaire lipolysemechanisme in zowel de maag- als de dunne darmfase.