Ecologie en moleculaire biologie van bacteriële adaptatie aan pesticiden

Pesticiden zijn onmisbaar voor een stabiele voedselvoorziening en het gebruik ervan neemt wereldwijd toe.  Ze vormen echter een belangrijk milieuprobleem vanwege hun recalcitrant karakter en hun toxiciteit voor niet-doelwitorganismen, en ondanks de steeds strengere regelgeving, blijven pesticiden op vele locaties de opgelegde drempelwaarden voor grond- en oppervlaktewater overschrijden. Om dit persistentievraagstuk aan te pakken, is een beter begrip van het lot van pesticiden en hun residuen in het milieu essentieel. Bacteriële biologische afbraak bepaalt in belangrijke mate dat lot en vormt de enige route voor hun volledige verwijdering. De bacteriële biologische afbraak van pesticiden werd uitgebreid bestudeerd en toch blijft het werkelijke afbraakpotentieel in complexe omgevingen zoals bodem onvoldoende begrepen, evenals de ogenschijnlijk snelle evolutionaire trajecten die leiden tot de afbraakwegen die bacteriën in staat stellen pesticiden te gebruiken als groeisubstraat. Het doel van dit doctoraat was om meer inzicht te krijgen in de bacteriële ecologie van pesticideverwijdering en in de bacteriële aanpassing wat betreft de afbraak van pesticiden in bodems en in on-farm biozuiveringssystemen (BPS's) die worden gebruikt in de behandeling van pesticide verontreinigd afvalwater op boerderijen.

Het eerste deel van de studie beöogde na te gaan of de eerdere blootstelling van een landbouwgrond aan het fenylureumherbicide linuron resulteerde in een genetisch geheugen voor linuron-biodegradatie in de bacteriële gemeenschap. Bovendien werd onderzocht of linuron-afbrekende bacteriën behorend tot het genus Variovorax, eerder geïsoleerd en geïdentificeerd als linuron-afbeker, instrumenteel zijn voor dat genetische geheugen of eerder slechts artefacten zijn van de isolatieprocedure. Daartoe werden de in situ afbrekende organismen van linuron voor het eerst bepaald door de cultivatie-onafhankelijke “DNA-stabiele isotoop-probing” (DNA-SIP) technologie in combinatie met 16S rRNA-genamplicon-sequenering, dit naast klassieke kweekafhankelijke isolatie. Beide benaderingen resulteerden in de toewijzing van Variovorax als sleutel linuron-afbrekers en dus als de sleutel voor het behoud van het genetische geheugen van linuron-degradatie in de onderzochte bodem dit ondanks periodes zonder linuronbehandeling. De resultaten bevestigden daarmee de besluiten van eerdere studies en het belang van het genus Variovorax voor in situ linuron-verwijdering in de onderzochte bodem. Desalniettemin vertegenwoordigden de twee nieuwe linuron-afbrekende Variovorax isolaten, genotypen die verschilden van deze geïdentificeerd via DNA-SIP en vormen ze een voorbeeld van het mogelijk vertekende beeld van klassieke cultivatie-afhankeljke isolatiemethodes.   

Het tweede deel van de studie richtte zich op het identificeren van de in situ linuron-afbrekers in een BPS-omgeving. Net als in het eerste deel werd hiertoe DNA-SIP toegepast en werden parallel, vanuit hetzelfde materiaal, BPS-materiaalvrije aanrijkingsculturen bestudeerd. DNA-SIP identificeerde, naast Variovorax, ook Ramlibacter als sleutelorganisme in in situ linuron-degradatie, een organisme dat voordien nooit in verband werd gebracht met linuron-biodegradatie. De aanrijkingsculturen daarentegen bestonden uit gemeenschappen gedomineerd door Variovorax maar die geen Ramlibacter bevatten wat wederom het vertekend beeld van cultivatieafhankelijke technieken aangeeft. Bovendien toonde DNA-SIP de betrokkenheid in in situ linuron-afbraak van verschillende genen eerder gekoppeld aan linuron-katabolisme in Variovorax en hun waarschijnlijke inbedding in IS1071-composiettransposons en IncP-1-plasmiden.

In het laatste deel van de studie werd de rol van linuron-gepreconditioneerde bacteriële gemeenschappen in de afbraak van de structureel gelijke verbindingen chloorprofam en chloortoluron onderzocht om inzicht te krijgen in de rol van het genetisch geheugen voor linuron-afbraak bij adaptatie, bijvoorbeeld door uitwisseling van complementaire katabole genmodules. Het met linuron gepreconditioneerde BPS-materiaal bestudeerd in deel twee, werd gebruikt als modelsysteem vanwege het eerder bevestigde genetische geheugen voor linuron-biodegradatie. Daarnaast fungeerden niet-gepreconditioneerd BPS-materiaal en een zelfgemaakt BPS-materiaal nooit eerder aan pesticiden blootgesteld (benoemd als OF/O) als controles. De drie materialen werden regelmatig gedoseerd met chloorprofam en chloortoluron dit gedurende 17 maanden en gecontroleerd op de mineralisatie van het respectievelijke pesticide, terwijl de organismen/genfuncties betrokken bij de afbraak geïdentificeerd werden door DNA-SIP en cultivatieafhankelijke aanrijking. De resultaten toonden een positief effect van linuron-preconditionering op de mineralisatie van chloorprofam en chloortoluron. De waargenomen effecten werden echter verklaard door een reeds aanwezige capaciteit om deze verbindingen af te breken gemedieerd door een subset van de aanwezige linuron-afbrekers eerder dan door genetische uitwisseling. Dit werd bevestigd door de waargenomen vertraagde mineralisatieactiviteit voor beide verbindingen in het OF/O-materiaal en het voorkomen van identieke afbrekers in alle materialen. De DNA-SIP-analyses identificeerden verder nooit eerder vermelde genera als afbrekers voor alle geteste verbindingen en suggereerden dat het substraatbereik van de linuronhydrolase LibA chloorprofam omvat.

De bekomen resultaten breiden onze kennis uit wat betreft de in situ biologische afbraak van pesticiden in zowel de bodem als BPS-omgeving, in het bijzonder met betrekking tot de afbraak van linuron, chloorprofam en chloortoluron. Voor alle bestudeerde verbindingen werden tot nog toe onbekende afbrekers geïdentificeerd met behulp van het cultivatie-onafhankelijke DNA-SIP, terwijl de bias geassocieerd met klassieke aanrijkings en isolatiemethoden tot uiting kwamen. Ten slotte droeg dit proefschrift bij aan de schaarse kennis die beschikbaar is over de aanpassing van bacteriën aan pesticiden en de rol van het genetisch geheugen daarin. Deze informatie is belangrijk voor een beter begrip van het gedrag en lot van pesticiden in het milieu en van de onderliggende mechanismen van de biologische afbraak van pesticiden in bodems en in bioremediatiesystemen zoals BPS.