De ontwikkeling van de VersaTile techniek en een microdruppel assay om op grote schaal lysines aan te passen tot antibacteriële middelen

De ontdekking en ontwikkeling van antibiotica heeft onze moderne geneeskunde mogelijk gemaakt. Jammer genoeg komt onze gezondheidzorg meer en meer onder druk te staan door antimicrobiële resistentie. Ondanks de initiële waarschuwingen leidde overconsumptie en misbruik van antibiotica tot de ontwikkeling en verspreiding van antimicrobiële resistentie tegen alle bestaande antibiotica. Bovendien hebben vele farmaceutische bedrijven het onderzoek en de ontwikkeling van nieuwe antibiotica verlaten omdat nieuwe screening campagnes teleurstellend en financieel onhoudbaar bleken te zijn.

De combinatie van een steeds verdere verspreiding van antimicrobiële resistentie en het falen om voldoende nieuwe antibiotica te ontwikkelen, dwong de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) in 2014 tot de gedurfde uitspraak dat de wereld zich bevindt aan het begin van een tijdperk waar antibiotica niet meer zouden werken als er geen drastische actie ondernomen wordt. Nu stelt Centers for Disease Control and Prevention dat we reeds dit tijdperk zijn binnengetreden. Rapporten geven aan dat als er geen nieuwe antibiotica gevonden worden, er jaarlijks 10 miljoen mensen wereldwijd zullen sterven, landbouwgewassen zullen verdwijnen en dit zal leiden tot een wereldwijd economisch verlies van 2,1 tot 124 biljoen (1012) dollar tegen 2050. Door deze hoge nood is het onderzoek naar zowel oude als nieuwe behandelingen sterk gestegen.

Lysines zijn peptidoglycaanhydrolasen die gebruikt worden door bacteriofagen. Sinds 2001 worden lysines intensief onderzocht om te gebruiken als antibacterieel middel. Hun werkingsmechanisme is gebaseerd op de inductie van osmotische lysis na het afbreken van de peptidoglycaanlaag. Het eerste lysine wordt momenteel geëvalueerd in een fase III klinische studie tegen bacteriëmie en endocarditis veroorzaakt door Grampositieve multiresistente Staphylococcus aureus stammen. De WHO-lijst van kritieke prioriteitspathogenen waarvoor nieuwe antibiotica dringend nodig zijn, wordt echter gedomineerd door gramnegatieve pathogenen. Helaas vertonen de meeste natuurlijke lysines een geringe of geen antibacteriële werking tegen gramnegatieve bacteriën vanwege de aanwezigheid van een buitenmembraan dat als schild fungeert. Door een buitenmembraan-permeabiliserend peptide te fuseren met een lysine, kan het omvangrijke lysine door het buitenmembraan gaan en gramnegatieve bacteriën doden door peptidoglycaanafbraak. Lysines hebben een modulaire samenstelling en kunnen een module bevatten die bindt aan de bacteriële celwand en een module die het peptidoglycaan zal afbreken. Deze opdeling maakt het mogelijk om de eigenschappen van lysines aan te passen door modules van verschillende lysines samen met diverse peptiden te recombineren. Deze eigenschap wordt het modulariteitsprincipe genoemd.

Jammer genoeg kan het volledige potentieel van het modulariteitsprincipe niet benut worden omdat er geen methode bestaat die het aanmaken van de combinaties op grote schaal toelaat. Daarom hebben we VersaTile ontwikkeld, een nieuwe DNA assembly techniek. Deze methode is gebaseerd op de intrinsieke eigenschap van type IIs restrictie enzymen om buiten hun herkenningssequentie te knippen, gecombineerd met de zeer precieze ontwikkeling van positie tags. Met behulp van Nanopore sequencing konden we aantonen dat VersaTile geen voorkeur vertoont in het assembleren van aangepaste lysines. Met de huidige technologie is het onmogelijk om alle aangepaste lysines te analyseren, daarom ontwikkelden we een iteratief “hit-to-lead” proces dat gebruik maakt van deepwell platen. Een subset van varianten werd geanalyseerd en ontwerpregels werden geëxtraheerd uit de beste varianten. De VersaTile-techniek werd opnieuw gebruikt om kleinere bibliotheek aan te maken op basis van deze ontwerpregels. Analyse van deze nieuwe bibliotheek leidde tot meer en verbeterde lysinevarianten die uiteindelijk onder strengere voorwaarden werden gescreend om een top variant te identificeren. Deze iteratieve aanpak leidde tot de ontdekking van een nieuw aangepast lysine 1D10 dat actief bleek te zijn in menselijk serum tegen multiresistente Acinetobacter baumannii-stammen. Bovendien vertraagt lysine 1D10 de bacteriegroei en biofilmvorming in een varkenshuidmodel dat (brand)wonden simuleert.

Omdat lysine 1D10 het enige actieve lysine was uit de vorige screen wilde we meer inzicht krijgen in de unieke eigenschappen van dit lysine. Door time-lapse microscopie te gebruiken konden we een duaal werkingsmechanisme achterhalen. In plaats van de explosieve lysis die we kennen van andere (aangepaste) lysines, maakt 1D10 kleine gaatjes in de bacterie waarlangs de inhoud van de bacterie naar buiten lekt. Door de functie van elke module in lysine 1D10 te analyseren, konden we het volgende aantonen: (i) een linker is noodzakelijk voor de antibacteriële activiteit, (ii) de CBD is niet essentieel maar verhoogt de activiteit wel, (ii) de EAD is verantwoordelijk voor de hoge thermoresistentie, (iv) het tweedelig werkingsmechanisme van 1D10 komt door het gedeeltelijk behouden van de antibacteriële activiteit van Cecropin A en de celwandafbraak van de EAD. Tot slot konden we aantonen dat 1D10 geen toxiciteit vertoont tegen een HaCaT epitheliale cellijn.

Met de huidige deepwell plaat assay was het maar mogelijk om ongeveer 4 % van de varianten in een bank van 10.000 varianten te analyseren. Dit is echter slechts het topje van de ijsberg. Daarom hebben we een nieuwe screeningsassay ontwikkeld om de mogelijkheden van VersaTile volledig te benutten. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van de ultieme miniaturisatie van een bioreactor: een microdruppel. Door gebruik te maken van water-in-olie druppels die aangemaakt worden door microfluidische chips, hebben we een assay gebouwd die potentieel miljoenen druppels kan screenen. De assay start met het inkapselen van een bank van aangepaste lysines tezamen met “rolling circle based” amplificatie mengsel in water-in-olie druppels. Nadat het DNA vermeerderd is, zal er een in vitro transcriptie/translatie mengsel worden toegevoegd om het aangepaste lysine tot expressie te brengen. Daarna zal de bacterie van interesse samengevoegd worden met een substraat om esterase activiteit te detecteren. Wanneer de bacteriën gelyseerd worden door de aangepaste lysines, zullen zij intracellulaire esterasen vrij zetten. Deze esterasen zullen een fluorescent signaal genereren dat we zullen gebruiken om “fluorescence activated droplet sorting” uit te voeren om zo de actieve varianten te scheiden van de niet-actieve varianten. Tot slot zal het DNA geëxtraheerd en opgezuiverd worden voordat we de sequentie van de aangepaste lysines kunnen bepalen via Nanopore sequencing. We toonden aan dat de microfluidische assay werkt door een screening uit te voeren met een positieve controle, het natuurlijke lysine LysRODI, en een bank van 15.000 aangepaste lysines tegen Staphylococcus aureus SA9.