Beheersing van bacteriële pathogenen bij de opkweek van kolen en prei

Plantenziekten veroorzaakt door bacteriën zijn een belangrijke oorzaak van productieverliezen in de landbouw, vooral omdat er momenteel geen efficiënte bestrijdingsmiddelen beschikbaar zijn. In kruisbloemige groenten, behorend tot het species Brassica oleraceae (vb. kool, bloemkool en spruitjes) en in prei zijn de belangrijkste bacteriële ziekten respectievelijk zwartnervigheid, veroorzaakt door Xanthomonas campestris pv. campestris, en bacteriebrand, veroorzaakt door Pseudomonas syringae pv. porri. In dit werk werd het potentieel van bacteriofagen onderzocht als biologisch bestrijdingsmiddel. Bacteriofagen zijn virussen die specifiek bacteriën infecteren, zich erin vermenigvuldigen en bij de vrijstelling van de nieuw gevormde partikels de gastheer lyseren.

In een eerste luik werden er bacteriën geïsoleerd uit plantenweefsel met symptomen. De bacterie isolaten werden geïdentificeerd op species niveau door een partiële sequentie van een huishoudgen, typisch aanvaard als barcode voor het species, te vergelijken met de sequentie van stammen in GenBank van NCBI. Nadien werd de pathovar bepaald door middel van pathogeniteitstesten. Dit leidde tot de identificatie van 36 X. campestris pv. campestris and 37 P. syringae pv. porri isolaten, waaruit blijkt dat zij de meest voorkomende ziekteverwekkers zijn gerelateerd aan de typische symptomen en dus verantwoordelijk zijn voor de grote economische verliezen in de kool- en preiproductie. De isolaten werden verder gekarakteriseerd door analyse van hun genomische diversiteit met behulp van BOX-PCR fingerprinting. Dit verdeelde de P. syringae pv. porri isolaten in twee groepen. Door genoomsequentie-analyse werd een ‘draft’ genoom samengesteld voor een stam uit elke groep. Hieruit kon afgeleid worden dat de verschillen tussen deze groepen zich voornamelijk situeren in de aanwezigheid van mobiele genetische elementen zoals profagen en IS elementen. In silico MLSA en ANIb toonden daarenboven aan dat beide stammen fylogenetisch meest verwant zijn aan P. syringae pv. oryzae, een pathogeen op rijst en zoals prei ook een monocotyl. Binnen X. campestris pv. campestris werd er een veel grotere diversiteit vastgesteld, zowel in hun GyrB sequentie als met behulp van BOX-PCR fingerprinting. Er werd een collectie aangelegd met de bacterie isolaten die in dit onderzoek werden verzameld en deze collectie werd verder aangevuld met referentiestammen van verwante pathovars en andere bacteriële pathogenen van kool en prei uit de LMG en CFBP collectie.

In een tweede luik werden de bacteriecollecties vervolgens gebruikt in aanrijkingstechnieken om bacteriofagen te isoleren uit bodemstalen die verzameld werden op velden met besmette planten. Zeven nieuwe fagen werden geïsoleerd voor X. campestris pv. campestris en deze kregen de naam SoPhi1-7. Vijf nieuwe fagen werden geïsoleerd voor P. syringae pv. porri, deze werden KIL1-5 genoemd en aangevuld met een h-mutant faag KIL3b die geselecteerd werd omwille van zijn uitgebreidde gastheerspectrum. Van de nieuwe fagen werd hun microbiologische geschiktheid voor faagtherapie doeleinden onderzocht. Hun morfologie werd bepaald aan de hand van transmissie elektronenmicroscopie. Deze analyses identificeerden SoPhi1, SoPhi2 en al de KIL fagen als leden van de Myoviridae familie. Hun gastheerspectrum werd bepaald aan de hand van infectie-experimenten met bacterie-isolaten uit de aangelegde bacteriecollecties. Alle fagen werden geschikt bevonden voor faagtherapie omdat ze een strikt lytisch karakter hebben en omdat ze stabiel zijn bij temperatuur en pH condities die voorkomen in een landbouwomgeving. Van enkele fagen werd het genoom volledig gesequeneerd en geanalyseerd om de kans op lysogenie en de aanwezigheid van genen coderend voor toxines uit te sluiten. De genoomanalyse van SoPhi7 toonde aan dat deze een genoomlengte heeft van 315 kb en verwant is met een andere ‘giant’ faag PhiKZ, die Pseudomonas aeruginosa infecteert. Omdat deze faag transducerende eigenschappen heeft kan SoPhi7 beter niet gebruikt worden voor faagtherapie totdat verder onderzoek garantie voor veiligheid geeft. Op basis van hun genoomsequenties konden de P. syringae pv. porri fagen taxonomisch geklasseerd worden als een nieuwe subgroep binnen het genus Felixounavirus, genaamd de “KIL-like viruses”.

In het derde deel van dit eindwerk werd het in planta effect van de fagen geëvalueerd. Eerst werden er faag-assay’s uitgevoerd op koolplantjes. Alle X. campestris pv. campestris fagen bleken voldoende antibacterieel potentieel te hebben, behalve faag SoPhi6. Bij de fagen SoPhi3 en SoPhi5 was de symptoomvermindering bovendien significant. Vervolgens werden er verschillende toedieningswijzen uitgetest in potproeven. Wanneer toegediend aan de bodem reduceerde faag SoPhi2 symptoomontwikkeling in geïnoculeerde bladeren, een indicatie voor systemische verplaatsing van de faag. Het vernevelen van faag SoPhi2 op de bladeren van bloemkoolplantjes kort voor de inoculatie met bacteriën zorgde voor significant minder symptomen. Tenslotte onderzochten veldproeven het potentieel van fagen in een ongecontrolleerde omgeving. Deze toonden aan dat het planten van natte bloemkoolplantjes op besmette velden tot een verhoogde aantasting leidt en dus vermeden moet worden. Er werd bovendien geen effect gevonden van een faagbehandeling vóór het uitplanten van bloemkoolplantjes in een besmet veld. Het vernevelen van fagen op de bladeren van grote bloemkoolplanten zorgde in één proef voor minder aantasting. In prei toonden de faagtesten op blaadjes het antibacterieel vermogen aan van alle P. syringae pv. porri fagen waarbij KIL1, KIL2, KIL3 en KIL3b bovendien voor een significant kleinere lesielengte zorgden. Bij de potproeven vond geen succesvolle bacterie-infectie plaats waardoor er geen conclusies konden bekomen worden. Tijdens de veldproeven werd er een significant verminderde aantasting vastgesteld in één proef waarbij de preiplantjes met fagen behandeld werden vóór aanplanting op een besmet perceel. Het vernevelen van fagen op de bladeren van volwassen planten verminderde de symptomen in twee opeenvolgende proeven.

Uit de resultaten van dit onderzoek kan men besluiten dat de geïsoleerde fagen in staat zijn om zwartnervigheid in kool en bacteriebrand in prei te verminderen, maar dat verder onderzoek nodig is om een effectieve formulering en toedieningswijze te ontwikkelen die de betrouwbaarheid van faagtherapie moeten ondersteunen