Gestimuleerde emissie depletie microscoop (STED)

Sinds de introductie van de confocale microscopie in de jaren '80 is geavanceerde lichtmicroscopie onmisbaar geworden in het biowetenschappelijk onderzoek. De wens om steeds meer details te zien heeft nieuwe ontwikkelingen in de lichtmicroscopie gestimuleerd. Hoewel de natuurkundige wetten een fundamentele limiet voorspelden voor de maximaal haalbare optische resolutie, was Dr. Stephan Hell een van de eersten die zich realiseerde dat deze limiet misschien niet zo onoverkomelijk was als werd aangenomen. Dankzij de vooruitgang in fluorescerende labels en lasertechnologie toonden hij en anderen aan dat het mogelijk was om voorbij de resolutielimiet van licht te visualiseren met een diverse reeks technologieën die nu "superresolutiemicroscopie" of "nanoscopie" worden genoemd.

Wellicht de meest toepasbare vorm van "nanoscopie" is "Stimulated Emission Depletion" (STED) nanoscopie, waarbij gebruik wordt gemaakt van twee samenvallende laserstralen die over het monster worden gescand om een beeld te genereren. De eerste laserstraal dient, zoals bij confocale microscopie, om de fluoroforen te exciteren, terwijl de tweede laserstraal een 'donut'-vorm heeft die de fluorescentie onderdrukt, behalve in het midden. Dit levert een effectieve resolutie op van 30 - 80 nm, vergelijkbaar met de grootte van bijvoorbeeld een ribosoom.

STED-nanoscopie is ideaal voor monsters waarin structuren niet kunnen worden gescheiden vanwege de resolutielimiet. Alle monsters die compatibel zijn met confocale microscopie kunnen worden gebruikt, mits de labels, het dekglaasje (#.15) en de brekingsindex van het monster compatibel zijn met STED.

De microscoop is uitgerust met drie objectieven, één voor confocale beeldvorming (20X, NA 0,8) en twee voor STED-beeldvorming met verschillende brekingsindexen (60X, olie, NA 1,42 en 60X siliconenolie, NA 1,3). STED kan worden uitgevoerd met kleurstoffen die compatibel zijn met de 775 nm of 595 nm gepulseerde depletielaser en de vier excitatielasers (405 nm (CW), 485 nm (gepulseerd), 561 nm (gepulseerd), 640 nm (gepulseerd)). Detectie geschiedt door APD-puntdetectoren die één foton tellen of door een matrixdetector waarmee achtergrondsignalen kunnen worden gereduceerd.

Een verbetering van de resolutie is mogelijk in zowel axiale als laterale richting met behulp van de 3D bundelvormingsmodule. Waarneming van de fluorescentielevensduur is mogelijk. Een Z-drift compensatiesysteem en transmissie- en epifluorescentiebelichtingssystemen zijn aanwezig.

Levende monsters zijn mogelijk met behulp van de kooi-incubator voor CO2-, temperatuur- en vochtigheidsregeling. Lichtblootstelling kan worden geminimaliseerd door een adaptief verlichtingsschema om photobleaching en toxiciteit te verminderen.