Functionele reconstitutie van type 3 proteïne-targeting en secretie

Type III-secretie (T3S) is een gespecialiseerd eiwitexport- en -afgiftesysteem voor eiwittoxines. Deze effectoren worden rechtstreeks in het cytoplasma van eukaryote gastheercellen geïnjecteerd via een speciale nano-injectiespuit, het injectisoom, dat zich uitstrekt over twee bacteriële en één eukaryote membraan. Eenmaal uitgescheiden, interfereren effectoren met signaalroutes van de gastheer en moduleren ze cellulaire processen, wat leidt tot de dood van de gastheercel. De T3SS is wijdverbreid en essentieel voor het pathogene en symbiotische potentieel van veel Gram-bacteriën. Het is verantwoordelijk voor verschillende ernstige ziekten, zoals pest (Yersinia pestis), buiktyfus (Salmonella enterica) en infantiele bacteriële diarree (Enteropathogene E. coli; EPEC) die tot miljoenen jaarlijkse sterfgevallen leiden. Ondanks aanzienlijke vooruitgang bij het begrijpen van de moleculaire basis van eiwittransport door het injectisoom, blijft het exacte mechanisme ongrijpbaar.T3SS is een van de meest complexe systemen voor eiwitsecretie die we kennen. Om functioneel te worden, werken maximaal 40 verschillende eiwitten, in honderden exemplaren, op een hiërarchische manier samen en assembleren ze.Ondanks sequentieverschillen tussen verschillende pathogene en flagellaire T3SS-subeenheden, delen alle kerncomponenten een significante structurele homologie, wat wijst op afkomst. Daarom wordt de eiwitfunctie in één bacterie gewoonlijk afgeleid door homologie en / of biochemische gelijkenis met die in andere soorten.Montage en afscheiding via de T3SS is stapsgewijs, hiërarchisch en nauwkeurig afgestemd. Het systeem zorgt ervoor dat structurele componenten eerst worden uitgescheiden om het injectisoom te bouwen, gevolgd door de effectoren. De assemblage van het T3SS-apparaat gebeurt in verschillende stappen: a) vorming van het basale lichaam, b) vorming van de naald en translocators door uitscheiding van respectievelijk vroege en middelste substraten, c) overschakelen van translocators naar effectoren (late substraten) en injectie van de laatste in het cytoplasma van de gastheer. Tijdens midden- tot late substraatwisseling reguleert de poortwachter SctW de membraantargeting van chaperonne / secretoire eiwitcomplexen naar SctV. SctV-gebonden SctW verhoogt de bindingsaffiniteit van de vroege en onderdrukt die van late substraten voor SctV. Conformatieveranderingen in het cytoplasmatische domein van SctV zouden de sortering en targeting van eiwitten kunnen reguleren, maar deze hypothese blijft ongetest.De positionering van het ATPase-complex / C-ring op het cytoplasmatische grensvlak van het exportapparaat heeft geleid tot de hypothese dat deze componenten essentieel zijn voor het sorteren / targeten van eiwitten. Deze perifere componenten worden echter gemakkelijk van het membraan losgemaakt, hun associatie is vrij dynamisch en zijn niet essentieel voor in vitro targeting van secretoire eiwitten. Daarom moet de rol van het ATPase-complex / C-ring bij het sorteren worden verduidelijkt. Aangenomen wordt dat de primaire energiebron voor T3SS-secretie afkomstig is van de proton-aandrijfkracht over het binnenmembraan, terwijl wordt aangenomen dat ATP-hydrolyse chaperonne / secretoire eiwitcomplexen dissocieert. Desalniettemin blijft het exacte stimulerende mechanisme dat nodig is voor eiwittranslocatie ongrijpbaar.Het gedetailleerde moleculaire mechanisme waarmee eiwitten interageren met het exportapparaat om te worden afgeleverd, het pad binnengaan en uitgescheiden worden, de volgorde van de gebeurtenissen en de interacties die plaatsvinden om hiërarchische secretie mogelijk te maken, evenals de structuur met hoge resolutie van het apparaat zijn enkele van de fundamentele vragen die moeten worden beantwoord. Tot nu toe was het ontcijferen van dit complexe mechanisme voornamelijk gebaseerd op in vivo genetische analyse, pull-down assays en hoge resolutie structuren van sommige componenten en / of van injectisomen in tomogrammen van hele cellen. Tot dusverre toegepaste benaderingen hebben een aantal inherente beperkingen. In vivo fenotypische observatie van deleties van enkele genen geeft geen informatie over tussenstappen van eiwittranslocatie. Proberen eiwitinteracties in kaart te brengen en affiniteiten in oplossing te bepalen met behulp van membraaneiwitdomeinen en secretoire eiwitfragmenten resulteerde in geen gedetecteerde interacties of 30-voudig lagere affiniteiten in vergelijking met degene die werden onderzocht met behulp van membraanblaasjes met functionele injectisomen. Het ontbreken van gezuiverde en gereconstitueerde translocase is een kritiek obstakel. Monitoring van eiwittranslocatie in vitro is een belangrijke stap in de richting van een beter begrip van de fundamentele aspecten van de T3SS-functie en de moleculaire basis van de regulering van het systeem. De complexe en dynamische aard van interacties tussen T3SS-componenten vereist nieuwe benaderingen om de volgorde van gebeurtenissen tijdens secretie te ontleden.Het voorgestelde onderzoek combineert geavanceerde structurele dynamica-methoden, zoals single molecule FRET (smFRET) en Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS), om de rol van conformationele dynamica van injectisome componenten te decoderen, met structurele analyse met hoge resolutie, in vitro functionele testen en reconstructie van het eiwitafgiftemechanisme.Het doel van het wetenschappelijk onderzoek is om de sortering, targeting en secretie van T3SS-eiwitten aan te pakken. Door gebruik te maken van de bestaande kennis over de T3SS-route, zal analyse van secretieroutes in biochemische en biofysische aard worden gedaan met drie hoofddoelstellingen:een. Structurele en functionele karakterisering van de SctV-receptor:1) opzetten van in vitro assays om SctV-interactie met oplosbare T3S-proteïne / of chaperonne / secretoire proteïnecomplexen te volgen;2) bepaal de structuur van nonameric-SctV;3) globale structurele dynamiek van Peptidisc-gereconstitueerde SctV door HDX-MS;4) bepalen van conformatieveranderingen en allosterische gebeurtenissen die optreden op SctV bij interactie met chaperonne / secretoire eiwitcomplexen.b. Structurele en functionele karakterisering van het holo-exportapparaat SctRSTUV:1) reconstrueer een stabiel holo-exportapparaat (SctRSTUV) in vitro;2) een in vitro assay opzetten om de T3S-eiwitbinding op het gereconstitueerde exportapparaat te volgen;3) bepaal de structuur van het holo-exportapparaat.c. Reconstitutie van afgifte / afgifte van secretoire eiwitten aan het exportapparaat in vitro.1) biochemische karakterisering van de assemblage van T3SS cytoplasmatische componenten op het holo-exportapparaat;2) het in kaart brengen van de geëxporteerde eiwitmodus van SctV-kruising en -afgifte.En de gevestigde en nieuwe tools worden gebruikt in vitro assays om:een. deconvolueren de volgorde van gebeurtenissen tijdens eiwitsecretie door het injectisoom;b. decodeer de rol van de conformationele dynamiek van het exportapparaat.Het verduidelijken hiervan zal een belangrijke stap zijn om de regelgeving van het systeem te begrijpen.En verschillende biomedische / biotechnologische verwachte toepassingen zijn:een. beter begrip van bacteriële infectieziekten;b. recombinante vaccins afgeleid van T3SS-geëxporteerde antigenen;c. nieuwe testen voor antivirulentieverbindingen die essentiële biochemische stappen blokkeren die hier geïdentificeerd zijn in samenwerking met het in-house geneesmiddelenontwikkelingsbedrijf CD3 aan de KUL.Tijdens het onderzoek zal FReT3 worden gematerialiseerd door het combineren van biochemische en biofysische tools, HDX-MS, smFRET en hoge resolutie EM om gedetailleerde functionele, structurele en dynamische inzichten te verwerven over T3SS proteïne-targeting en secretie.een. SctV zal in vitro structureel en functioneel gekarakteriseerd worden via een intercontinentaal-samenwerkingsnetwerk. Peptidisc-technologie is een universele biochemische benadering met hoge verwerkingscapaciteit om membraaneiwitcomplexen stabiel in oplossing te houden, waarbij incompatibele buffers voor biofysische methoden, zoals detergentia en kunstmatige lipidedubbellaag, worden vermeden. Peptidisc-reconstitutie zal de pijpleiding zijn die wordt gebruikt om de structuur van SctV te bepalen door Cryo-EM, in samenwerking met het Marlovits-lab (CSSB, Hamburg).Verder zal de receptorfunctie van SctV worden geanalyseerd met behulp van gezuiverde T3SS chaperonne / secretoire eiwitcomplexen en biofysische tools, zoals isotherme titratiecalorimetrie (ITC) (voor affiniteitsmetingen en thermodynamische parameters) en grootte-uitsluitingschromatografie in lijn met multi laserhoek. lichtverstrooiing (SEC-MALS) en natieve massaspectrometrie (voor complexvorming stoichiometrieën).b. De structurele dynamica van Peptidisc-gereconstitueerde SctV, zal worden bestudeerd door HDX-MS, dat uniek krachtig is in het verschaffen van gedetailleerde informatie over conformationele flexibiliteit en dynamiek tot bijna residueniveau. De gevestigde HDX-MS-protocollen die zijn uitgebreid tot het karakteriseren van in membraan ingebedde Sec-eiwitcomplexen zullen worden toegepast op de T3SS om de globale structurele dynamiek van SctV op zichzelf en in aanwezigheid van verschillende substraten te bepalen, zoals de poortwachter SctW, de chaperonne. / secretoire eiwitcomplex CesT / Tir of CesF / EspF dat met nanomolaire affiniteit aan SctV binden.Bovendien bewaakt smFRET intra- en intermoleculaire dynamica en probes conformationele veranderingen in een eiwit, door FRET-efficiëntie van een donor-acceptor fluorofoorpaar te berekenen als een functie van de tijd en deze om te zetten in een inter-probe-afstand. Deze complementaire biofysische techniek zal worden gebruikt om de verschillende conformationele toestanden van elk SctV-protomeer te volgen, binnen de nietamere context, aangezien secretoire eiwitten binden aan SctV. Conformationele veranderingen die door smFRET worden gecontroleerd, zullen worden onderzocht met behulp van confocale microscopie in oplossing met behulp van de MIcrotime200 (Picoquant). Terwijl HDX-MS de gemiddelde D-opname van een peptide van alle protomeren van de SctV nonameer zal volgen en intramoleculaire veranderingen zal monitoren, zal smFRET de conformationele dynamiek in een enkel protomeer van de nonameer monitoren.c. Reconstitueer het complete T3SS-exportapparaat in vitro. Het T3SS-exportapparaat omvat vijf binnenmembraaneiwitten SctR / S / T / U / V in EPEC. Alle vijf genen zijn al gekloond in verschillende expressievectoren afzonderlijk of in operons. Een verscheidenheid aan heterologe expressiestammen zal worden getest om de eiwitsynthese te maximaliseren en zuivering zal worden uitgevoerd met milde, niet-ionische detergentia, zoals alleen voor SctV. Zodra het eiwitcomplex in vitro is gereconstitueerd, zal de hierboven opgezette pijplijn (zie "a") worden gevolgd voor structurele en functionele karakterisering met behulp van Cryo-EM en biochemische benaderingen.d. Er is een test opgezet om T3S-translocatie in vitro te volgen met behulp van IMV's en gezuiverde chaperonne / secretoire eiwitcomplexen. Met behulp van radioactief gelabelde geëxporteerde eiwitten monitoren we de eiwitafgifte in het lumen van de vehikels. Deze reactie zal worden gekoppeld aan biochemische activiteiten zoals het monitoren van ATP-hydrolyse door de ATPase van het systeem dat zal worden geleverd in trans. Om de assemblage-eisen van de complete set van perifere componenten te bepalen, hebben we genetische constructies gegenereerd die overexpressie en zuivering van de componenten alleen of in combinaties mogelijk maken. Alle gezuiverde oplosbare complexen zullen primair worden gekarakteriseerd met SEC-MALS en ITC voor bepaling van complexvorming en affiniteiten. Bovendien zullen we met behulp van live-celbeeldvorming, cryoEM en in vitro translocatie-assays de afgifte van secretoire eiwitten in het lumen van IMV's volgen en de structurele dynamiek van het exportapparaat tijdens het proces oplossen.

Trefwoorden:T3SS, secretory proteins, functional reconstitution

Disciplines:Infectieziekten, Bacteriologie, Cellulaire interacties en extracellulaire matrix, Moleculaire fysiologie, Structurele biologie

Project type:PhD project