Proteïnesamenstelling en fysicochemische eigenschappen van sojaproteïne-isolaten en hun rol in structuurvorming tijdens ‘high moisture extrusion’

De huidige (gedeeltelijke) transitie van dierlijke naar plantaardige proteïnen heeft er voor gezorgd dat er een verhoogde interesse is in kwalitatieve plantaardige proteïne-ingrediënten. Onder de plantaardige proteïnebronnen worden sojabonen [Glycine max (L.) Merr.] zeer frequent gebruikt omwille van hun hoog proteïnegehalte en nutritionele kwaliteit. De proteïnetransitie heeft er ook voor gezorgd dat de interesse stijgt in vleesanalogen gebaseerd op plantaardige proteïnen die de sensorische eigenschappen van vleesproducten nabootsen. ‘High moisture extrusion (HME)’ is een techniek die kan gebruikt worden om met bijvoorbeeld sojaproteïnen producten te vervaardigen met een gelaagde of vezelachtige structuur. In systemen met maar één component, zoals het gebruik van sojaproteïne-isolaat (SPI, proteïnegehalte > 90%), wordt verondersteld dat het aligneren van proteïnestrengen en het optreden van synerese (i.e. het vrijkomen van water uit een gel of proteïnennetwerk), beide als gevolg van de vorming van (niet-)covalente interacties en bindingen tijdens het HME proces, verantwoordelijk zijn voor het vormen van een anisotrope structuur. Deze hypotheses zijn voornamelijk gebaseerd op empirische studies die werden uitgevoerd met commerciële SPI’s, die meestal worden gekenmerkt door een hoge graad van proteïnedenaturatie, een lage dispergeerbaarheid en die vaak een onbekende (proteïne)samenstelling hebben. Ondanks dat deze karakteristieken vaak worden waargenomen in commerciële SPI’s, ontbreekt het aan informatie over de invloed van de toegepaste proteïne-isolatie condities op de proteïnesamenstelling en fysicochemische eigenschappen van SPI. Bovendien is aangetoond dat beide SPI eigenschappen een impact hebben op het vormen van een proteïnenetwerk tijdens een hittebehandeling, maar hun invloed op structuurvorming tijdens HME is grotendeels onbekend.

Dit doctoraatsproefschrift had daarom als voornaamste doelstelling om meer inzicht te verkrijgen in de rollen van de proteïnesamenstelling en fysicochemische eigenschappen van SPI’s in het bepalen van structuurvorming tijdens HME. Om dit te kunnen bestuderen, is ook een diepgaande kennis van de factoren die deze SPI eigenschappen bepalen noodzakelijk. Dit proefschrift beoogde daarom ook om de impact van variërende isolatie condities op de fysicochemische eigenschappen en proteïnesamenstelling van SPI systematisch te bestuderen.

Om de impact van verwerkingsstappen op de sojaproteïnesamenstelling te kunnen bestuderen, werd eerst een ‘size-exclusion’ chromatografie (SE-HPLC) methode ontwikkeld om kwantitatief de sojaproteïnesamenstelling op het niveau van subeenheden te kunnen bepalen. Analyse onder denaturerende en reducerende condities maakte het mogelijk om proteïnen met een moleculair gewicht (MG) ≥ 97 kDa, 7S globuline α+α’- en β-subeenheden, 11S globuline A- en B-subeenheden en 2S albuminen te detecteren en kwantificeren.

Als ‘proof-of-concept’ werd deze SE-HPLC methode eerst gebruikt om de variabiliteit in de proteïnesamenstelling van Belgische soja te analyseren. In dit proefschrift werden sojabonen gecultiveerd in België gebruikt als grondstof voor het experimentele werk. Er is vandaag nagenoeg geen informatie beschikbaar over de invloed van variëteit en cultivatiecondities op de proteïnesamenstelling van Belgische soja. Daarom werd de samenstelling van drie sojavariëteiten (Sioux, Bettina en Lenka) bestudeerd in functie van oogstjaar, teeltlocatie en inoculatiestrategie. Zowel het genotype als het oogstjaar hadden een significante invloed op de proteïnesamenstelling van Belgische sojastalen, maar de invloed van teeltlocatie en het gebruikt van verschillende inoculanten of geen inoculant was beperkt. Alle factoren hadden dan weer wel een invloed op de chemische samenstelling van soja. Gemiddeld hadden Sioux-stalen het hoogste proteïnegehalte (51%) en de laagste 7S/11S globuline ratio (0.50), terwijl Bettina-stalen het laagste proteïnegehalte hadden (39%) en de hoogste 7S/11S globuline ratio (0.65).

Sojabloemstalen van Sioux, Bettina en Lenka werden vervolgens gebruikt om de impact van een conventioneel sojaproteïne-isolatieproces onder variërende condities, i.e. (i) ontvetting met hexaan gevolgd door (ii) alkalische extractie (pH 7.0-9.0), (iii) zure precipitatie (pH 3.5-5.5) en (iv) vries- of sproeidrogen, op de graad van proteïnedenaturatie, dispergeerbaarheid en proteïnesamenstelling van sojaproteïnen te onderzoeken. Dit laatste aspect werd bestudeerd met de hierboven vermelde SE-HPLC methode. Zowel ontvetting met hexaan als alkalische extractie veroorzaakten geen proteïnedenaturatie. Het verhogen van de pH gebruikt voor alkalische extractie zorgde wel voor een verhoogde proteïneopbrengst. Zure precipitatie bij pH 5.5 gevolgd door neutralisatie resulteerde in SPI’s met hogere proteïnegehaltes en dispergeerbaarheden, maar met lagere 7S/11S globuline ratio’s en met 7S globulinen met een iets lagere thermische stabiliteit in vergelijking met zure precipitatie bij pH 3.5 en 4.5. Belangrijk om te vermelden is dat de geobserveerde pH-afhankelijke trends niet werden beïnvloed door de voor de isolatieprocedure gebruikte sojavariëteit. Alle verkregen SPI’s hadden een relatief hoge proteïnedispergeerbaarheid (80-100%) en enkel (gedeeltelijke) denaturatie van 2S albuminen werd geobserveerd. Ook sproeidrogen zorgde niet voor een verlaagde dispergeerbaarheid of proteïnedenaturatie in vergelijking met vriesdrogen. De conclusie kon daarom getrokken worden dat de hoge graad van proteïnedenaturatie en de lage dispergeerbaarheid die typisch zijn voor commerciële SPI’s, wellicht kunnen worden toegeschreven aan de additionele verhittingsstap die doorgaans toegepast wordt in industriële SPI-productieprocessen. Ten slotte werd geobserveerd dat dispersies van alle SPI’s, onafhankelijk van de gebruikte proteïne-isolatie condities, naast natieve globulinen een aanzienlijke hoeveelheid geaggregeerde proteïnestructuren bevatten. Dit kan een invloed hebben op de functionele eigenschappen van SPI, maar dit moet verder onderzocht worden.

In het laatste deel van dit proefschrift, werd de invloed van variërende (i) fysicochemische eigenschappen en (ii) proteïnesamenstelling van SPI op de structuur en textuur van ‘high moisture’ extrudaten onderzocht in twee afzonderlijke hoofdstukken.

Om de invloed van variërende fysicochemische eigenschappen, hier opgevat als verschillen in de graad van proteïnedenaturatie en dispergeerbaarheid, te kunnen onderzoeken werden SPI’s met (i) dispergeerbare en niet-gedenatureerde proteïnen, (ii) gedenatureerde, niet-dispergeerbare en geaggregeerde proteïnen of (iii) mengsels daarvan gebruikt voor HME-verwerking op labo-schaal. De meeste dispergeerbare en niet-gedenatureerde proteïnen namen deel aan zowel niet-covalente interacties als disulfidebindingen tijdens HME en dit resulteerde in een gelaagde extrudaatmicrostructuur waarin waterrijke domeinen te zien waren die mogelijk wijzen op het optreden van synerese. Zelfs na het verbreken van niet-covalente interacties en disulfidebindingen, werden in het extrudaatextract aggregaten met een hoog MG (> 100 kDa) gedetecteerd met de SE-HPLC methode. De aanwezigheid van gedenatureerde, niet-dispergeerbare en geaggregeerde proteïnen naast dispergeerbare en niet-gedenatureerde proteïnen in de grondstof resulteerde in extrudaten met een hogere hardheid en snijvastheid, maar resulteerde ook in een gelaagde extrudaatstructuur. Het gebruik van enkel gedenatureerde, niet-dispergeerbare en geaggregeerde proteïnen voor HME-verwerking resulteerde in een extrudaat met een vezelige structuur zonder tekenen van synerese en met een textuur gelijkaardig aan die van het extrudaat gebaseerd op dispergeerbare en niet-gedenatureerde proteïnen. Extrusie van de gedenatureerde, niet-dispergeerbare en geaggregeerde proteïnen veroorzaakte geen verdere verlaging van de proteïne-extraheerbaarheid of veranderingen in de MG-verdeling. Daarom werd verondersteld dat sterk geaggregeerde proteïnen die reeds aanwezig zijn in de grondstof, niet worden afgebroken tijdens HME-verwerking, waardoor ze waarschijnlijk in mindere mate beschikbaar zijn voor het vormen van nieuwe proteïne-proteïne interacties en bindingen. Dit zou ook kunnen verklaren waarom er in dit geval wellicht geen synerese optrad tijdens extrusie. Er is hierrond echter nog meer onderzoek vereist.

Om de invloed van proteïnesamenstelling te kunnen bestuderen, werden fracties aangerijkt in soja 7S of 11S globulinen gemengd in verschillende verhoudingen en gebruikt als grondstof voor HME-verwerking op labo-schaal. De fractie aangerijkt in 11S globulinen, gehydrateerd tot 60% (w/w) vocht, vertoonde vloeistofachtig gedrag en het gebruik ervan voor HME bij eenzelfde vochtgehalte resulteerde in een extrudaat met onregelmatige structuur. Het toevoegen van de fractie aangerijkt in 7S globulinen, die op zichzelf in gehydrateerde vorm een meer elastische structuur had, aan de grondstof resulteerde in een gelaagde extrudaatstructuren. Alle extrudaten vervaardigd met grondstof die de fractie aangerijkt in 7S globulinen bevatte, hadden een gelijkaardige textuur. Extrudaat op basis van de fractie aangerijkt in 11S globulinen bleek voornamelijk gestabiliseerd door disulfidebindingen, terwijl het verhogen van de 7S globulineconcentratie in de grondstof er voor zorgde dat de relatieve bijdrage van niet-covalente interacties toenam. Disulfidebindingen werden voornamelijk gevormd door 11S globuline A- en B-subeenheden. Enkele 7S globuline α/α’-subeenheden namen ook deel aan de vorming van disulfidebindingen, maar 7S globuline β-subeenheden waren hier niet bij betrokken. De hoog MG aggregaten die ook in het extrudaat gebaseerd op dispergeerbare en niet-gedenatureerde proteïnen werden gedetecteerd, bestonden voornamelijk uit 11S globuline B-subeenheden bij gebruik van grondstof aangerijkt in 11S globulinen en uit 7S globuline α/α’-subeenheden bij gebruik van grondstof aangerijkt in 7S globulinen.

Concluderend kan gesteld worden dat de bevindingen van dit doctoraatsproefschrift nieuwe inzichten heeft opgeleverd rond de samenstelling van (Belgische) soja en de factoren die SPI eigenschappen beïnvloeden. Beide zijn zeer relevant voor de functionele eigenschappen van proteïne-ingrediënten gebaseerd op soja. Er kan ook geconcludeerd worden dat voornamelijk de fysicochemische eigenschappen van SPI een invloed hebben op (micro)structuur en -textuur van extrudaten geproduceerd met HME. Verschillen in fysicochemische eigenschappen en proteïnesamenstelling tussen commerciële SPI’s kunnen echter wel verantwoordelijk zijn voor de grote variabiliteit die in de literatuur wordt waargenomen met betrekking tot de mate waarin en het type proteïne-proteïne interacties en bindingen die gevormd worden tijdens HME.