De cannabinoïde receptor signalering als doelwit voor het ontdekken en karakteriseren van geneesmiddelen: Een focus op CB1- en CB2- cannabinoïde receptoren en GIRK1/GIRK2- kaliumkanalen

De cannabinoïde (CB) receptoren hebben recentelijk veel aandacht getrokken van wetenschappers omwille van hun therapeutisch potentieel voor diverse ziekten, vooral bij neurologische aandoeningen.

CB1- en CB2-receptoren zijn G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) en behoren tot het endocannabinoïdesysteem. Het zijn pleiotrope signaalmoleculen en ze dragen bij aan het herstel van homeostase, wat de therapeutische mogelijkheden voor de behandeling van meerdere aandoeningen benadrukt. Daarom zijn er uitgebreide inspanningen geleverd om liganden voor deze receptoren te ontwikkelen. Dit heeft geresulteerd in honderden synthetische cannabinoïden en fytocannabinoïden met verschillende affiniteiten voor deze receptoren. Vanwege de belangrijke expressie van de cannabinoide receptoren in het menselijke brein, zijn de CB receptoren interessante doelwitten voor de behandeling van verschillende neurologische aandoeningen. Ondanks deze vooruitgang wordt momenteel slechts een klein aantal van deze liganden als geneesmiddelen gebruikt.

GIRK1/GIRK2-kanalen zijn een onmisbaar onderdeel van de signaaltransductie in het menselijk brein na activering van GPCR's, waaronder de CB-receptoren, door neurotransmitters. GIRK kanalen zijn dus belangrijk voor de fysiologie en pathologie in de hersenen. Desalniettemin is het therapeutisch potentieel van GIRK1/GIRK2-kanalen tot op heden grotendeels onbenut gebleven, voornamelijk omdat het gebrek aan krachtige en selectieve farmacologische hulpmiddelen voor het bestuderen van GIRK1/GIRK2-kanalen de vooruitgang in het begrijpen van hun fysiologische en pathologische relevantie beperkt. Tot voor kort kwamen selectieve GIRK1-bevattende activatoren en -remmers naar voren als potentiële therapieën. Er is echter nog geen geneesmiddel succesvol ontwikkeld op basis van GIRK-liganden. 

Er is dus behoefte aan nieuwe, krachtige en selectieve liganden voor zowel CB-receptoren als GIRK1/GIRK2 kanalen. Zowel agonisten/activators als antagonisten/remmers zijn interessante hulpmiddelen bij het ophelderen van de rol van deze membraaneiwitten in normale celfysiologie en bij ziekte. In dit doctoraatsproject rapporteren we de ontdekking en karakterisering van nieuwe liganden gericht op de CB-receptorsignalering, met een focus op de CB1-, CB2-receptoren en de GIRK1/GIRK2-kanalen. Om dit doel te bereiken, hebben we natuurlijke bronnen, d.w.z. dierlijke giffen en toxines, onderzocht om zo nieuwe liganden te ontdekken. Dierlijk gif kan worden gezien als een onbenutte cocktail van biologisch actieve verbindingen die krachtig, stabiel en snel fysiologische doelwitten zoals receptoren en ionenkanalen manipuleren. Giftige dieren zijn gespecialiseerde roofdieren die de meest geavanceerde peptidechemie en neurofarmacologie hebben ontwikkeld voor hun biologische doeleinden door gif te produceren dat een structurele en functionele diversiteit aan neurotoxines bevat.

In HOOFDSTUK 1 hebben we een betrouwbaar en solide expressiesysteem opgebouwd en gevalideerd waarbij CB1- en CB2-receptoren zijn gekoppeld aan G-proteïne-gekoppelde, naar binnen rectificerende kaliumkanalen (GIRK1/GIRK2) en een regulator van de G-eiwitsignalering (RGS4). Al deze proteïnen werden tot expressie gebracht in Xenopus laevis oocyten. Dit ex vivo systeem, gecombineerd met elektrofysiologische metingen met behulp van de two-electrode voltage-clamp (TEVC) techniek, heeft de ontdekking mogelijk gemaakt van een breed scala aan liganden die orthosterisch of allosterisch interageren met de CB1- en/of CB2-receptoren. WIN55,212-2, een niet-selectieve agonist van CB1 en CB2, werd gebruikt om de functie van het CB-GIRK1/GIRK2-RGS4-expressiesysteem te valideren. We laten zien dat WIN55,212-2 de CB1- en CB2-receptoren activeerde bij lage concentraties, terwijl het bij hogere concentraties een directe inhibitie van de GIRK1/GIRK2-kanalen veroorzaakt. Dit illustreert een dubbele modulerende functie die nog niet eerder is beschreven. Deze ontdekking helpt bij het verklaren van de nadelige effecten veroorzaakt door WIN55,212-2 in vivo. Bij het vergelijken van de effecten met andere typische cannabinoïden zoals THC, CBD, CP55,940 en Rimonabant, kon alleen WIN55,212-2 de GIRK1/GIRK2-kanalen aanzienlijk blokkeren. Interessant is dat het naar binnen gerichte kaliumkanaal (IRK1), een niet-G-proteïne-gekoppeld kaliumkanaal dat belangrijk is voor het instellen van de rustmembraanspanning en sterk lijkt op GIRK1- en GIRK2-kanalen, niet gevoelig was voor WIN55,212-2, THC, CBD, CP55,940 of Rimonabant. Hieruit wordt geconcludeerd dat WIN55,212-2 selectief GIRK1/2 blokkeert.

In HOOFDSTUK 2 hebben we een screening van dierlijke gifstoffen en toxines uitgevoerd met behulp van het CB-GIRK1/GIRK2-RGS4-expressiesysteem en het GIRK1/GIRK2-kanaal dat tot expressie gebracht werd in oocyten. Bijgevolg ontdekten we dat de fractie A12 van het gif van Anemonia sulcata een potentiële activator van GIRK1/GIRK2-kanalen bevat en dat het kleine molecule oleoyl serotonine (OS), afkomstig uit het gif van Stephanoconus-slakken, een potentiële blokker van CB-receptoren is. Verder opzuiveren heeft geleid tot de identificatie en karakterisering van de actieve component in de fractie A12. Dit wordt beschreven in HOOFDSTUK 3. De karakterisering van de in vitro en in vivo activiteit van OS wordt beschreven in HOOFDSTUK 4.

In HOOFDSTUK 3 rapporteren we dat het toxine-peptide AsKC11 de potentiële activator in de venoom fractie A12 van het gif van Anemonia sulcata is. We hebben eerst het actieve peptide AsKC11 uit de fractie A12 gezuiverd en geïsoleerd met behulp van de omgekeerde-fasechromatografie. Massaspectrometrie werd gebruikt om de sequentie van AsKC11 te identificeren. Met behulp van de TEVC-techniek werd de activiteit van AsKC11 op GIRK1/GIRK2-kanalen bestudeerd en werd de selectiviteit voor andere kaliumkanalen onderzocht. Als resultaat ontdekten we dat AsKC11 een Kunitz-type peptide is. Het is eveneens het eerste peptide waarvan is aangetoond dat het direct neuronale GIRK1/GIRK2-kanalen activeert, onafhankelijk van Gi/o-proteïneactiviteit, zonder het IRK1-kanaal te beïnvloeden en met slechts een gering effect op spanningsafhankelijke kaliumkanaal Kv1.6. AsKC11 is dus een nieuwe activator van GIRK-kanalen, wat resulteert in grotere K+-stromen vanwege een verhoogde kanaal activiteit.

In HOOFDSTUK 4 laten we zien dat OS verschillende antagonistische effecten heeft op de twee subtypes van CB-receptoren en hierdoor mogelijke therapeutisch potentieel heeft voor de behandeling van angst. De activiteit van OS op CB-receptoren en de selectiviteit ervan op verschillende receptoren en kanalen wordt onderzocht met behulp van de TEVC-techniek. Om de essentiële domeinen van de CB-receptor te verkennen, hebben we een nieuwe chimere CB1/2-receptor ontwikkeld. Hiervoor werd het transmembraandomein V(TMV)-intracellulaire lus 3 (ICL3)-TMVI-domein van de CB2-receptor vervangen door het overeenkomstig gedeelte van de CB1-receptor. Ten slotte evalueren we de in vivo effecten van OS op de neurologische functies met behulp van muismodellen die specifiek ontwikkeld zijn om een reeks gedragstesten te evalueren. OS is een competitieve antagonist voor de CB1-receptoren en een niet-competitieve antagonist van de CB2-receptoren. Het onderzoek naar de structuur-activiteit relatie onthult dat de chimere receptor een CB2-achtig karakter behoud wat betreft de interactie met de CB-agonist WIN55,212-2. Het TMV-ICL3-TMVI-domein van CB2 is noodzakelijk voor OS om zijn antagonistische effect op CB2-receptoren uit te oefenen. Ons onderzoek bij muizen laat zien dat OS een anxiolytisch effect heeft. Dit onderzoek onderstreept het potentieel van componenten uit dierlijk gif als een waardevolle bron voor nieuwe CB-receptorliganden die de ontwikkeling van geneesmiddelen gericht op CB-receptoren kunnen bevorderen.

Samenvattend bieden deze ontdekkingen nieuw inzichten in het vinden van bruikbare hulpmiddelen voor het onderzoeken van de fysiologische rol en het therapeutisch potentieel van de CB-receptoren en de GIRK1/GIRK2-kanalen. Deze nieuwe liganden maken de weg vrij voor het ontwerpen en ontwikkelen van geneesmiddelen voor de behandeling van neurologische aandoeningen.