Microfluïdische chip voor het volledig elektrisch vastleggen, spectraal analyseren en sorteren van cellen met individuele cel resolutie

Micro-organismen, zoals gisten of bacteriën, vormen heterogene populaties bestaande uit meerdere subpopulaties. In de afgelopen decennia zijn tal van technologieën voor single-cell analyse ontwikkeld om deze fenotypische heterogeniteit in een populatie te bestuderen en cellen met interessante eigenschappen te identificeren. Optische technieken zijn wijdverspreid en succesvol toegepast voor dit doel, maar ze hebben een aantal nadelen. Ze zijn duur, vereisen omvangrijke apparatuur en hebben monsterbereiding nodig voor celmarkering (Flow cytometry), of ze werken langzaam, waardoor het bemonsteren van een hele populatie tijdrovend is (Raman Spectroscopy). Elektrische technologieën winnen aan belang vanwege hun vermogen voor labelvrije en realtime analyse van elektrische cel eigenschappen die de bestaande optische technologieën kunnen complementeren. Bovendien hebben ze het potentieel om goedkoop en compact te worden, wat mogelijkheden opent voor draagbare toestellen die ter plekke single-cell analyse uitvoeren.

Impedantie flow cytometry (IFC) systemen maken elektrische karakterisering van micro-organismen in suspensie mogelijk door middel van snelle impedantiemetingen met individuele cel resolutie. De meeste systemen meten echter slechts bij twee frequenties, waardoor de informatie die over cellen wordt verkregen ernstig wordt beperkt. Impedantiespectroscopie over een breed frequentiebereik is wenselijk omdat de elektrische eigenschappen van subcellulaire kenmerken nauwkeuriger kunnen worden onderzocht. Bij lage frequenties bevat de meting bijvoorbeeld informatie over de celgrootte, terwijl bij hogere frequenties de eigenschappen van het celmembraan en het cytoplasma worden onderzocht.

CMOS-MEA (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor Microelectrode array) systemen kunnen breedbandige impedantiemetingen uitvoeren op duizenden elektroden op een zeer parallelle manier met individuele cel resolutie. De toepassingen zijn echter beperkt tot aanhankelijke cellen zoals weefsel of biofilms, omdat cellen dicht bij het elektrodeoppervlak moeten zijn. Om het gebruik van CMOS-MEA's voor cellen in suspensie mogelijk te maken, is er behoefte aan een volledig elektrische techniek die individuele cellen kan vastleggen, analyseren en sorteren. De techniek moet automatisering en on-chip-integratie mogelijk maken om een hoogdoorvoer- en compact systeem te realiseren.

Daarom is het doel van deze scriptie om de ontwikkeling van het eerste volledig elektrische systeem te pionieren dat drie essentiële functionaliteiten omvat: i) vangen, ii) spectrale impedantieanalyse en iii) selectief vrijgeven van individuele cellen. Het systeem moet het potentieel hebben voor automatisering, integratie op CMOS-chip en parallellisatie. Het tweede doel is om het systeem te gebruiken voor de elektrische karakterisering van micro-organismen om de biologische relevantie ervan te valideren, en daarbij verder dan de state-of-the-art te gaan om nieuwe biologische toepassingen te verkennen waar elektrische technieken nuttig kunnen zijn voor single-cell analyse.

In deze thesis wordt een microfluïdisch apparaat gepresenteerd dat voor het eerst een gecombineerde methode demonstreert voor volledig elektrisch vastleggen, analyseren en selectief vrijgeven van cellen met individuele cel resolutie. Alle functionaliteiten worden experimenteel gedemonstreerd op Saccharomyces cerevisiae. Het microfluïdische platform bestaat uit vallen gecentreerd rond een paar individueel adresseerbare coplanaire elektroden, gepositioneerd onder een microfluïdisch kanaal. Het apparaat maakt gebruik van een nieuwe methode voor het vangen van cellen door positieve dielectroforese (pDEP), die de "Two-Voltage" methode werd genoemd. Cellen worden naar de val getrokken wanneer een hoge spanning (VH) wordt aangelegd. Een lage spanning (VL) houdt de reeds gevangen cel op zijn plaats zonder extra cellen aan te trekken, waardoor volledige controle mogelijk is over het aantal gevangen cellen. Na het vangen worden de cellen geanalyseerd door breedband elektrochemische impedantiespectroscopie (EIS). Deze metingen maken de detectie van individuele cellen mogelijk en de extractie van celparameters. Bovendien tonen de metingen een sterke correlatie tussen gemiddelde faseverandering en celgrootte, waardoor ons systeem kan worden gebruikt voor groottemetingen in biologische toepassingen. Ten slotte maakt het apparaat het selectief vrijgeven van gevangen cellen mogelijk door het pDEP-signaal in hun val uit te schakelen.

Het frequentiebereik waarin cel-eigenschappen kunnen worden gemeten door impedantiespectroscopie wordt beperkt door twee effecten die de celimpedantie maskeren: de dubbele laag impedantie als gevolg van de elektrode-elektrolytinterface bij lage frequenties en de parasitaire capaciteit als gevolg van capacitieve koppeling tussen de metalen lijnen verbonden met de elektroden bij hoge frequenties. Deze thesis presenteert een nieuwe, extreem snelle (1 s) en eenvoudige on-chip nanostructureringsmethode voor gouden elektroden, die resulteert in een 40-voudige vermindering van de dubbele laag-impedantie bij 1 kHz. Nano-gestructureerde elektroden vertonen experimenteel een verbeterde impedantiestabiliteit en een hogere gevoeligheid voor celimpedantie. De benadering vereist alleen onderdompeling van de elektroden in een 100x verdunde PBS-oplossing en een gelijkstroomspanningsbron om de spanning toe te passen, zonder extra fabricage- of elektrodepositiestappen te vereisen. Bovendien wordt een op maat ontworpen PCB gepresenteerd die gebruik maakt van guarding technieken om parasitaire capaciteit tijdens celimpedantiemetingen te minimaliseren.

Ten slotte tonen single-cell metingen met het microfluïdische apparaat dat in deze scriptie wordt gepresenteerd, voor het eerst aan dat Chlorella vulgaris en Microcystis aeruginosa, twee veelvoorkomende soorten in zoetwateralgenbloei, kunnen worden gedetecteerd en onderscheiden op individueel celniveau door EIS. Controle-experimenten bevestigen dat vacuolen, kleine luchtzakjes, in het cytoplasma van M. aeruginosa-cellen de belangrijkste oorzaak zijn van het verschil in impedantie in vergelijking met C. vulgaris-cellen die geen vacuolen hebben.

Ter conclusie, het microfluïdische apparaat dat in deze thesis wordt gepresenteerd, valideert voor het eerst volledig elektrisch vangen, spectrale analyse en sorteren van individuele cellen. Impedantiespectroscopiemetingen van gist- en algencellen met het apparaat tonen het potentieel van breedbandimpedantiemetingen in de karakterisering van cel-eigenschappen. Hoewel er nog extra uitdagingen zijn, heeft het volledig elektrische apparaat het potentieel voor automatisering en integratie, wat nieuwe mogelijkheden opent voor kleinschalige, hoogdoorvoer single-cell analyse- en sorteersystemen.