Onderzoek naar bacteriële lysis door β-lactams met behulp van high-throughput microscopische analyses doorheen de tijd, en mechanische lysis van bacteriën door nano-oppervlakken

Bacteriolyse is een van de meest voorkomende manieren om bacteriën te doden. b-lactam antibiotica, antimicrobiële peptiden, glycopeptiden, faagtherapie en nanogestructureerde oppervlakten doden bacteriën voornamelijk door lysis te induceren. Een dieper begrip van bacteriolyseprocessen kan nieuwe manieren suggereren om bacteriële kolonisatie te voorkomen en antibioticumeffectiviteit te bevorderen.

In het eerste deel van dit werk hebben we een hoge-doorvoer microscopie-gebaseerde methodologie ontwikkeld voor het opvolgen van morfologische veranderingen in bacteriën ten gevolge van omgevingsperturbaties. Met behulp van ‘off-the-shelf’ microscopie hardware en software hebben we een protocol geïmplementeerd voor de beeldvorming van bacteriën in 96-well platen. Om de mogelijkheden van de methode te demonstreren, hebben we morfologische veranderingen en lysis van ca. 4000 Escherichia coli mutanten opgevolgd na behandeling met het b-lactam antibioticum cefsulodin. We ontwikkelden ook een nieuwe beeldanalyse pijplijn voor automatische classificatie van cellen gebaseerd op hun karakteristieke vorm en beeldintensiteit. Op basis van veranderingen in frequenties van celmorfotypes konden we mutanten identificeren die atypische morfologische dynamieken vertonen. De aberrante fenotypes werden geclusterd waardoor discrete morfologische responsen van mutanten op cefsulodin zichtbaar werden. De vorming van stabiele uitstulpingen in bepaalde mutanten stimuleert antibioticumtolerantie, doordat uitstulpende cellen in staan zijn om terug te reverteren naar normale groei nadat het antibioticum verwijderd is. De hier ontwikkelde methodologie is erg veelzijdig en kan gebruikt worden voor het vinden van genetische modulators van bacteriële morfologische responsen geïnduceerd door verschillende soorten perturbaties, bv. antibiotica.

In een tweede deel van deze thesis hebben we de beeldvormingsmethodologie van in het eerste deel gebruikt om de lysiskinetiek te meten van ca. 4000 E. coli mutanten tijdens behandeling met het b-lactam antibioticum cefalexin. We stelden vast dat de duur van filamentatie voor lysis sterk varieert tussen de verschillende mutanten en dat lysiskinetiek correleert met overleving. Vertraagde lysis leidt tot antibioticumtolerantie omdat gefilamenteerde cellen, na verwijdering van het antibioticum, succesvol meerdere gelijktijdige septaties kunnen ondergaan en delen in meerdere dochtercellen. We vonden dat deletie van de tol-pal genen tolQ, tolR, ybgC en pal resulteert in snelle lysis zonder filamentatie tijdens behandeling met b-lactams. Deze resultaten benadrukken het potentiële belang van antibioticumtolerantie gedurende antibioticumtherapie.

In het laatste deel beschrijven we antibacteriële activiteit van wattenstaafvormige nanostructuren. Deze nanostructuren doden bacteriën op een fysieke contact-afhankelijke manier. We ontwikkelden een biofysisch model vanuit infinitesimale vervormingstheorie om de effecten te onderzoeken van veranderingen in oppervlaktetopologie op bactericidale activiteit. We maakten verscheidene gecontroleerde geometrische variaties van de wattenstaafvormige nanostructuren. Metingen van bactericidale activiteit van deze nanostructuuroppervlakten bevestigden modelpredicties en benadrukten de niet-triviale rol van buigingsstijfheid van de celomslag in het bacteriolyseproces geïnduceerd door nanostructuren.

We kunnen besluiten dat de hoge-doorvoer tijdsgeresolveerde morfologie screeningsmethodologie die in dit werk gepresenteerd werd, een makkelijk implementeerbaar protocol biedt voor de snelle beeldvorming van grote aantallen bacteriële stammen en het analyseren op single-cell niveau van morfologische veranderingen ten gevolge van externe perturbaties. Bovendien leveren onze resultaten nieuwe inzichten die kunnen bijdragen tot de ontwikkeling van betere preventieve en curatieve strategieën voor de succesvolle bestrijding van bacteriële infecties.