Validatie van kandidaat genen in granulosacel en eicel met voorspellend vermogen voor ontwikkelingscompetentie (FWOKN208)

Uiteenzetting van het voorgestelde project De onderzoeksgroep Follikel Biologie (FOBI), die bestaat uit 7 vorsers heeft vorige 2 jaren door middel van microarrays op precies geidentificeerde cellen uit ovariële follikelkweek een reeks specifieke gekende en nog ongekende genen geidentificeerd binnen de eicel en de granulosacellen die haar omringen. Thans is het werk van de verschillende vorsers toegespitst op de validatie van deze genen die wellicht een belangrijke rol kunnen gaan vervullen als merker voor ontwikkelingscompetente eicellen (deze die zullen kunnen een embryo vormen) en binnen de verbetering van kultuuromstandigheden. Deze validatie dient te gebeuren door kwantitatieve RT-PCR op een klein aantal cellen (enkele honderden granulosacellen uit 1 follikel) van individuele follikels die dagelijks in kweek worden gezet in microtiterplaat met vele honderden tegelijk. Daar het de ultieme bedoeling is van relaties te vinden in cumuluscel (= de granulosacellen die de eicel omringen) en de bijbehorende eicel, zijn de vorsers thans genoodzaakt veel tijd te spenderen aan het uitvoeren van de extracties van RNA uit deze cellen. De vorsers werken rond verschillende projekten die volgende thema's omvatten: 1. het opsporen van merkers in cumuluscellen die een voorspellende waarde hebben voor de eicelkwaliteit en de regulatie van eicelspecifieke groeifactoren. 2. de invloed van farmaca en kultuurmilieu componenten op het primaire imprintingspatroon in de eicel. 3. de karakterisatie van genen in cumuluscellen van follikelaspiraten van infertiele vrouwen die de follikelrijping en de eicelkwaliteit kunnen bepalen. In het kader van het derde thema worden ter gelegenheid van routine ICSI behandelingen binnen het UZ Brussel bij één enkele patiënte gewoonlijk een gemiddelde van 10-12 eicellen opgepikt. Van de overeenkomstige cumuluscellen dient het RNA liefst in één enkele manipulatie zo snel mogelijk geextraheerd te worden. Deze stap is zeer laborieus en onderhevig aan variabiliteit indien deze per follikel dient te gebeuren. Samengevat: het werken met een gerobotiseerd systeem dat de extracties voor zijn rekening kan nemen en het uitvoeren van de PCR stappen in één plaat kan de uitvoeringscapaciteit van de onderzoeksgroep sterk verhogen. Er wordt verwacht dat de repetitieve manipulaties op deze wijze zullen gehalveerd worden en dat door deze automatisering de reproduceerbaarheid van de analyses gevoelig zal verbeteren. Hierna worden de thema's van de lopende projecten, waarvoor de gevraagde apparatuur zal ingezet worden kort uiteengezet. Thema 1: Processen in cumuluscellen gerelateerd aan eicelkwaliteit bij muis en mens Doel is het wetenschappelijk onderbouwen van de verschillen in genexpressie in de CC gerelateerd aan eicelkwaliteit die gevonden werden met behulp van RNA microarrays. Het project spitst zich toe op genen die verband houden met Ca2+-gerelateerde processen. Calcium en inositol 1,4,5,-trifosfaat (IP3) hebben een direct effect op de eicelcompetentie en beïnvloeden de steroïdogenese tijdens de follikulo-luteale transitie (Webb-2002,Amano- 2005). Bijgevolg zou het calcium metabolisme een merker kunnen zijn voor onder andere een verdere graad van differentiatie/luteïnisatie en eicelcompetentie of -maturiteit. (Veldhuis 1982, Younglai 2005). Verschillen in graad van follikelontwikkeling liggen aan de basis van eicelmaturatie verschillen. Dit kunnen we bevestigen door gebruik te maken van een goed gekarakteriseerd in vitro muismodel (Smitz en Cortvrindt 2002). In dit model worden individuele geïsoleerde vroeg preantrale follikels in cultuur gezet onder equivalente condities, waardoor er een synchrone ontwikkeling plaatsvindt gedurende 13 dagen. Hierdoor kan men de regulatie van de genen opvolgen tijdens de maturatie van de follikel en de eicel. Op deze wijze kan de invloed op het genexpressiepatroon ten gevolge van een verschil in follikelmaturatie (invloed van de grootte van de aangeprikte follikels) in kaart gebracht worden evenals de variatie in de tijd na toediening van de ovulatoire stimulus. De relevantie van de verschillen in genexpressiepatroon zal verder onderbouwd worden aan de hand van studies op proteïne-niveau met behulp van agonist en antagonist effect studies in het in vitro muismodel. De geselecteerde genen zullen aldus in vitro gemoduleerd worden om het effectief belang ervan na te gaan op eicelkwaliteit. In een tweede fase zal in de IVF-kliniek voor dit project een prospectieve studie opgezet worden. Deze zal voor de gekarakteriseerde genen de predictieve waarde, de patiënt-patiënt variatie en de invloed van stimulatieprotocols vastleggen. Dit onderzoek uitgevoerd op muis en mens zoekt een reeks genen met hoog predictief potentieel voor eicelkwaliteit en zal verwerkt worden tot een eicel kwaliteitstest. Om een geselecteerde genenpanel snel en efficiënt te kunnen valideren voor een cohorte eicel-cumulus complexen (gewoonlijk een 10- tal per patiënte) is een snelle, reproduceerbare en betrouwbare techniek noodzakelijk. Een automatisatie dringt zich dus op. Thema 2: Verstoring in imprintingspatroon na Medisch Begeleide Bevruchting: Studie naar de relatie tussen DNA methylatie in eicel en follikel cultuur omstandigheden in een muismodel. Om het hoofd te kunnen bieden aan de groeiende ongerustheid met betrekking tot imprinting stoornissen in kinderen die sporadisch zijn opgemerkt na geassisteerde voortplantingstechnologie, wensen we pro-actief de rol van wijziging in cultuurmedium en medicatie te onderzoeken in een goed gevalideerd diermodel. Het vermoeden is gerezen dat er een associatie bestaat tussen geassisteerde voortplantingstechnologie en aandoeningen met verstoorde imprinting in kinderen zoals het Beckwith-Wiedemann syndroom. Dit model kan een belangrijke rol spelen in de optimalisatie van in-vitro cultuurcondities van eicellen en dus de efficiëntie en veiligheid van in-vitro fertilisatie met gekweekte eicellen verhogen, ook in humane reproductie. Imprinted genen hebben een regulerende functie in proliferatie en differentiatie van cellen en spelen een essentiële rol in o.a. embryo en placenta ontwikkeling, postnatale groei, tumorsuppressie en humane genetische aandoeningen (zoals Beckwith-Wiedemann syndroom). In de muis werd aangetoond dat imprinting op verschillende tijdstippen tijdens de oögenese (postnataal) wordt verworven voor de verschillende imprinted genen: DNA methylatie start voor sommige imprinted genen op een vroegtijdig tijdstip tijdens oögenese en voor andere later (in bijna volgroeide eicellen). Deze epigenetische modificaties gedurende oögenese zijn noodzakelijk voor embryo overleving a term. Wijzigingen in het imprintingspatroon kunnen aan de basis liggen van het lage rendement van in-vitro gegroeide embryo's, hetgeen voorkomt in alle species. Er werd eveneens aangetoond dat in-vitro maturatie (IVM) van eicellen in mens en muis kan leiden tot verstoorde DNA methylatie van imprinted genen. De epigenetische en fenotypische punten van overeenkomst in het Large Offspring Syndrome (LOS) na embryo cultuur (in schaap en rund) en Beckwith-Wiedemann syndroom kunnen wijzen op een gezamenlijk mechanisme. De hypothese werd naar voor gebracht dat de combinatie van methionine depletie van eicellen in vrouwen tegen de 40 jaar met een methionine-vrij embryo cultuur medium kan leiden tot een tekort aan methionine in pre-implantatie embryos, met als gevolg hypomethylatie van DNA thv imprint controle centra, verantwoordelijk voor Beckwith-Wiedemann syndroom. Literatuurgegevens wijzen erop dat de metabole weg van methionine een belangrijke rol speelt in DNA methylatie en mogelijk liggen wijzigingen ervan aan de basis van verstoorde imprinting in pre-implantatie embryo cultuur en IVM. Er zijn belangrijke verschillen in methionine concentratie in gecommercialiseerde media voor embryo cultuur. Superovulatie werd geassocieerd met verstoorde imprinting in eicellen bij de muis en de mens. De hoge dosissen toegediend follikel stimulerend hormoon (FSH) spelen dus mogelijk een rol in verstoorde imprinting in eicellen. Dit kan te wijten zijn aan een direct effect van FSH of aan een indirect effect door verhoogde oestrogenen. Er werd immers aangetoond in de muis dat perinatale blootstelling aan diethylstilbestrol, een synthetisch niet-steroïde oestrogeen, kan leiden to demethylatie van DNA ter hoogte van verschillende genen. Doel van de studie: Voor onze studie gebruiken we het muis follikel cultuur model van Cortvrindt en Smitz, dat toelaat op reproduceerbare wijze onvolgroeide eicellen (vroeg preantraal) in een tijdspanne van 14 dagen te laten uitrijpen tot fertiliseerbare eicellen. Tijdens deze fase treedt een methylatie op van de imprinted genen Snrpn, Peg3 en Igf2r. Dit follikel cultuur systeem is geschikt als bioassay om de effecten van cultuur condities op DNA methylatie van imprinted genen gedurende eicel groei en maturatie na te gaan. We willen de effecten thv Igf2r en Snrpn bestuderen, 2 genen die gemethyleerd worden tijdens de oögenese en die geassocieerd worden met aberrante imprinting na ART. Deze studie is innoverend omdat er totnogtoe nooit een directe relatie, maar slechts een associatie, is aangetoond tussen bovenstaande cultuurcondities gedurende oögenese en verstoorde imprinting. De in-vitro benadering is analytisch interessant omdat we op meer nauwkeurige en reproduceerbare wijze dan in-vivo de invloed van homocysteine, ammonium en FSH kunnen testen gedurende de verschillende stadia van eicelgroei en maturatie. Thema 3: Karakterisatie van genen in de cumuluscellen die een rol spelen in folliculogenese en oogenese en kunnen leiden tot het praktisch gebruik als merkers in de fertiliteitskliniek. Teneinde de keuze van het unieke embryo onder de cohorte van gevormde embryos te kunnen bepalen zijn er meer dan alleen morfologische merkers nodig. Een werkhypothese van ons laboratorium is dat de karakterisatie van genen in de eicelomringende cumuluscellen hier een oplossing zouden kunnen bieden. Deze hypothese werd reeds bevestigd door het werk van Mc Kenzie et al(2005) die 3 genen beschreef in cumuluscelbiopten genomen op het ogenblik van de eicelcollecte die een voorspellende waarde hadden voor de blastocystvormingscapaciteit. Thans hebben wij na microarray-analyse van gepoolde patientencumuli, die al dan niet aanleiding gaven tot een doorgaande zwangerschap een lijst van ongeveer 150 kandidaatgenen geselecteerd die mogelijks een voorspellende waarde hebben voor zwangerschap. Een 10-tal genen werden uitgekozen voor verder prospectief onderzoek op individuele cumulussen, waarvan we exact het verdere verloop van eicelontwikkeling zullen kennen. De strategie om te werken op muisfollikel kulturen -om de folliculaire groeifase beter te karakteriseren- is gebaseerd op het feit dat we tijdens follikelgroei bij de mens geen mogelijkheid hebben om groeiende follikels aan te prikken om er cumuluscellen uit de isoleren. Uit de microarray analyse werden er ongeveer 200 genen weerhouden die een stijgend expressiepatroon vertonen in cumuluscellen gedurende de antrale groeifase. Deze genen behoren tot de volgende processen " cell-cell communication, metabolism, extracellular matrix processes, steroid metabolism and TGF-B signaling". Een deel van deze genen is nog niet gekend , andere zoals Epb4.1l3, Lgals4, Parp3 and Scn4 lijken een interessant expressieprofiel te vertonen en werden in 2007 verder onderzocht in nieuwe follikelkulturen die werden opgezet. De aanwezigheid en de expressie in-vivo werd ook nagegaan op proefdieren materiaal. Sommige van deze genen werden nog niet in het ovarium aangetoond, en blijken mogelijks een relatie te hebben met luteinisatie en/of eicel-overrijping. Deze genen zullen verder onderzocht worden op proteineniveau en hun regulatie zal nagegaan worden dmv follikelkulturen. We verwachten van op relatief korte termijn merkers te kunnen isoleren die een betere opvolging van de follikulaire groei mogelijk zullen maken en die een voorspellende waarde hebben naar de ontwikkelingscapaciteit van de bijbehorende eicel. Deze genen zouden de ontwikkeling van In-vitro maturatie van eicel-cumulus-complexen kunnen op een beter peil brengen en tevens de beslissing van welk embryo er dient teruggeplaatst worden vergemakkelijken.

Trefwoorden:reproductive genetics, andrology, clinical genetics, embryology, assisted reproductive technology

Disciplines:Basiswetenschappen, Biologische wetenschappen