Gebruik van fluorescerende sondes om farmacokinetiek bij zebravissen (Danio rerio) embryo's en larven te bestuderen

Ondanks het aantal beschikbare instrumenten voor het opsporen van toxiciteit in de pijplijn voor het ontdekken van geneesmiddelen, blijft het terugroepen van geneesmiddelen na het op de markt brengen als gevolg van toxische effecten een probleem in de farmaceutische industrie. De laatste jaren zijn er veel inspanningen geleverd om de voorspelbaarheid te verbeteren van in

vitro en in vivo modellen waarmee de veiligheidsprofielen van chemicaliën preklinisch worden bepaald. De zebravis (Danio rerio) biedt in dit verband nieuwe mogelijkheden. Zebravisembryo’s en -larven worden tegenwoordig erkend als een uitstekend alternatief niet-zoogdiermodel dat geschikt is voor HTS (highthroughput screening) met een zeer waardevolle vertaling van de resultaten naar de mens.

Bovendien zijn zebravissen gemakkelijk genetisch te manipuleren, wat de mogelijkheid biedt om cellulaire en genetische factoren te identificeren die pathologische reacties op toxische stoffen veroorzaken in mechanistische studies. Bijgevolg zijn er verschillende screenings voor veiligheidsbeoordeling beschikbaar waarbij gebruik wordt gemaakt van op de zebravis gebaseerde platformen die ontworpen zijn om de toxiciteit van farmaceutische producten, cosmetica en milieumonsters op een efficiënte manier te testen.

De meeste zebravis-gebaseerde testen gebruiken immersie als een praktisch haalbare manier om de vissen bloot te stellen aan de verbindingen. Tal van details tijdens en na de immersie-fase betreffende absorptie, distributie en eliminatie van chemische stoffen in embryo’s en larven van zebravissen zijn momenteel evenwel nog niet onderzocht. Als alternatief kunnen onderzoekers verbindingen micro-injecteren, maar hoe chemische stoffen zich in het lichaam verspreiden na een dergelijke micro-injectie en hoe de blootstelling van het lichaam zich verhoudt tot wat tijdens en na immersie wordt bereikt, is niet gekend. Gewoonlijk worden de blootstelling binnen het lichaam, de biologische beschikbaarheid en de farmacokinetische analyse van verbindingen uitgevoerd op basis van een bloedmonster of totaal verteerd weefsel van de zebravis als de meest gebruikte matrix. Op fluorescentie gebaseerde benaderingen kunnen echter worden gebruikt om het blootstellingsprofiel of het toxiciteitsprofiel van chemische stoffen te evalueren, met het voordeel van een evaluatie in real time, waardoor tijd en middelen worden bespaard en een hoge gevoeligheid en specificiteit wordt verkregen.

We onderzochten de spatiotemporele verdeling van zeven fluorescerende alkyne verbindingen tijdens en na immersie en na micro-injectie (in de dooierzak - IY, pericardiaal -PC of in de peritoneale holte -IP) van zebravis eleutheroembryo’s (ZFEE, 3 tot 5 dpf), alsook na immersie of IY micro-injectie van zebravisembryo’s (ZFE, 2 cel-stadium). De gebruikte concentratie (10 uM) en dosis (2 mg/kg) werden geselecteerd omdat deze typisch worden gebruikt in preklinische experimenten en andere zebravisstudies. De belangrijkste parameterwaarden van de farmacokinetiek van de verbindingen werden bepaald door het modelleren van de fluorescentie aanwezig in lichaamscontouren te zien op fluorescentiebeelden. Door een QSPkR (quantitative structure-pharmacokinetic relationship) analyse uit te voeren, identificeerden we LogDo/w als de enige fysisch-chemische eigenschap die de uiteindelijke opname van de geselecteerde verbindingen in het lichaam verklaart. De opname in het ZFE-dooiercompartiment werd daarentegen voornamelijk verklaard door TPSA (topologisch polair oppervlak), MR (molaire brekingscoëfficiënt) en de interactie van MR met LogDo/w.

We vonden verder dat vooral in het geval van korte incubaties (1-3 uur) bij 3 dpf, immersie kan resulteren in een beperkte blootstelling van het lichaam aan de verbindingen. In dit geval vormen PC- en IP-microinjecties uitstekende alternatieven. IY micro-injecties daarentegen resulteerden niet in een geschikte verdeling van de verbindingen in het lichaam (3 dpf). Bovendien ontdekten we dat een gecombineerde toediening van verbindingen (immersie en micro-injectie) zorgt voor een stabielere blootstelling van het lichaam aan de verbindingen (ZFEE), althans in het geval van een langdurige immersie en verbindingen met een LogDo/w waarde > 1. De resultaten tonen verder aan dat een zeer beperkte blootstelling van het lichaam werd bereikt na immersie van het 2 cel-stadium van de embryo’s, in het geval van hydrofiele verbindingen. In dit geval wordt de micro-injectie in de dooierzak ten zeerste aanbevolen. Deze technische procedure kan overigens gemakkelijk worden geautomatiseerd.

Tot slot hebben we het gebruik van specifieke fluorescentie-sondes gevalideerd, gericht op het testen van het inhiberende effect van BSEP-remmers met een cholestatisch profiel op de transportfunctie van zebravis Bsep (zebravis bile salt export pump transporter). Cholestase is een verstoring van de enterohepatische cyclus van galzuren die mogelijk resulteert in levertoxiciteit. Veel cholestase-inductoren zijn remmers van BSEP (human bile salt export pump transporter), een eiwit dat cruciaal is voor de afscheiding van galzuren uit levercellen in de gal. Met behulp van Tauro-nor als fluorescentie-sonde konden we de drie BSEP-remmers correct identificeren, terwijl de hepatotoxische geneesmiddelen geen significante reductie van de opname van Tauro-nor in de galblaas induceerden. De BODIPY™ FL C5-gebaseerde test classificeerde daarentegen ten onrechte ketorolac en paracetamol als Bsep-remmers. Uiteraard is verder onderzoek nodig om de interacties van de fluorescentie-sondes met de individuele efflux-transporters beter in kaart te brengen. Tevens moet een groter aantal geneesmiddelen worden getest, ook gebruik makende van larven met loss-of-function mutaties in specifieke transporters.

Samengevat kunnen we stellen dat onze resultaten en de wiskundige modellen die we hebben ontwikkeld in de toekomst zullen helpen om de hoeveelheid verbinding te voorspellen die na toediening in de zebravis aanwezig is via immersie, micro-injectie of gecombineerde immersie/micro-injectie, en dit op basis van de fysisch-chemische eigenschappen van de verbinding. Bovendien laten de hier getoonde resultaten de praktische bruikbaarheid van de fluorescente probes zien bij toepassing in het zebravismodel. De fluorescente probes bieden een gevoeligheid en specificiteit die in overeenstemming zijn met de HTSvoordelen van de zebravis. Evenzo bieden de PK-uitkomsten nuttige input die kan helpen bij het op maat maken van toekomstige veiligheidsbeoordelingen met gebruikmaking van het op de zebravis gebaseerde platform.