Studie van het antifungaal werkingsmechanisme van plantdefensinen via analyse van individuele gistcellen

Jaarlijks veroorzaken invasieve schimmelinfecties (ISIs) zoals candidemia en invasieve aspergillose, 1,7 miljoen doden wereldwijd. Dit cijfer stijgt nog steeds, wat voornamelijk verklaard kan worden door een stijging in het aantal risicopatiënten, nl. patiënten met een verzwakt immuunsysteem, en het verhoogd gebruik van moderne medische apparaten, zoals implantaten en katheters. Bovendien is het sterftecijfer, geassocieerd met ISIs, hoog (tot wel 50%) en het aantal gebruikte antimycotica beperkt. Vandaar is er een duidelijke nood aan nieuwe effectieve antifungale strategieën. Hierbij is het belangrijk om cellulaire heterogeniteit binnen schimmelpopulaties in acht te nemen. Deze heterogeniteit kan resulteren in een gedeelte van de populatie dat niet reageert op een antifungale behandeling, wat kan leiden tot het falen van deze behandeling en het terugkeren van infecties. Dit benadrukt het belang van ‘single cell’ analyses. Daarom focusten we in dit doctoraal onderzoek voornamelijk op het gebruik van ‘single cell’ technologieën om een meer diepgaand inzicht te krijgen in het werkingsmechanisme van verschillende antifungale componenten.

Het eerste doel van dit doctoraal onderzoek was om te focussen op de potentiatie van op dit moment gebruikte antimycotica, gezien de activiteit van antifungale geneesmiddelen verhoogd kan worden door deze te combineren met een niet-antifungaal middel, een zogenaamde potentiator. Met een zelf ontwikkeld digitaal ‘microfluidic’ platform, bestudeerden we het antifungale werkingsmechanisme van het polyeen antifungale geneesmiddel amfotericine B (AmB) door de kinetiek van endogeen geproduceerde superoxide-radicalen en membraanpermeabilisatie in gist te analyseren. We toonden aan dat (i) de stikstofoxide donor S-nitrosoglutathion de antifungale werking van AmB vermindert, waardoor het lijkt te fungeren als een tolerantiemechanisme, en (ii) door deze ‘pathway’ te blokkeren met behulp van de stikstofoxide-synthase-inhibitor L-NAME, de antifungale werking van AmB verhoogt in Saccharomyces cerevisiae en humane pathogenen, Candida albicans en Candida glabrata. Potentiatie van AmB resulteerde bijgevolg in een snellere antifungale activiteit en een lagere vereiste AmB dosis.

Het tweede doel van dit doctoraal onderzoek was om te focussen op het gebruik van specifieke antimicrobiële plantpeptiden (AMPs), nl. plantdefensinen, die een verschillend werkingsmechanisme hebben in vergelijking met huidige antimycotica. Plantdefensinen hebben een breed-spectrum antifungale activiteit, zijn normaliter niet toxisch voor humane cellen en interageren met specifieke schimmeldoelwitten. Aanvankelijk onderzochten we het antifungale werkingsmechanisme van het plantdefensine HsAFP1 (Heuchera sanguinea) in ‘bulk’. Via transcriptoomanalyse van C. albicans cellen, behandeld met HsAFP1, en daaropvolgende genetische en biochemische testen konden we vaststellen dat glycosylphosphatidylinositol (GPI)-verankerde proteïnen betrokken zijn bij de internalisatie van HsAFP1, wat vereist is voor diens antifungale activiteit. Daarnaast toonden we aan dat matige HsAFP1-dosissen resulteerden in autofagie, terwijl hoge HsAFP1-dosissen vacuolaire disfunctie induceerden. Vervolgens onderzochten we het antifungale werkingsmechanisme op ‘single cell’ niveau door gebruik te maken van een zelf ontwikkeld continu ‘microfluidic’ platform. We onderzochten de afhankelijkheid van de inductie van reactieve zuurstof species en membraanpermeabilisatie in ‘single’ gistcellen doorheen de tijd, maar binnen een tijdspanne van 2 minuten, vertoonden bijna alle onderzochte cellen geen tijdsverschil tussen beide gebeurtenissen, wat wijst op sterk dynamische en gecorreleerde processen.

Concluderend hebben we gebruikgemaakt van twee ‘single cell’ platformen: een digitaal ‘microfluidic’ platform en een continu ‘microfluidic’ platform, om de verschillende antifungale behandelingsstrategieën te onderzoeken bij een verhoogde resolutie. Hierbij verworven we een meer diepgaand inzicht in het antifungale werkingsmechanisme bij potentiatie van huidige antimycotica en van plant defensinen, wat van groot belang is voor de ontwikkeling van nieuwe antifungale geneesmiddelen.