De 3D niet-natieve code voor eiwit sortering en targeting

Proteïnen zijn essentieel voor het leven: ze zorgen voor celdeling en geven structuur/beweging aan cellen en weefsels. Alle proteïnen worden gesynthetiseerd door ribosomen in het cytoplasma als niet-gevouwen aminozuurketens die hun correcte cel locatie moeten vinden en hun functionele vorm moeten aannemen. Deze processen zijn belangrijk: proteïnemislokalisatie en -misvouwing zijn schadelijk en leiden tot ziektes. In Gram-negatieve bacteriën vormt het binnenste membraan een barrière tussen het cytoplasma en het periplasma. In de model Gram-negatieve bacterie, Escherichia coli, is ongeveer 35% van alle proteïnen gelokaliseerd in en actief in extra-cytoplasmatische locaties. Deze geëxporteerde proteïnen moeten gesorteerd worden van cytoplasmatische proteïnen en geïncorporeerd worden in het binnenste membraan (membraanproteïnen) of het binnenste membraan overschrijden (secretoire proteïnen). De belangrijkste translocatieroute van het binnenste membraan is de essentiële en alomtegenwoordige SecYEG-SecA.
Bijna alle membraanproteïnen worden co-translationeel, terwijl ze gesynthetiseerd worden, geïncorporeerd via de Sec route, membraanincorporatie en vouwing hand in hand gaande. Het mechanisme achter deze co-translationele route verzekert de translocatie-competente conditie door proteïne(mis)vouwing en aggregatie te vermijden. De meeste secretoire proteïnen overschrijden het binnenste membraan post-translationeel via de Sec route, het onderwerp van mijn onderzoek.
In de post-translationele route zijn de nieuwgevormde preproteïnen voor het grootste deel reeds gesynthetiseerd wanneer de secretieroute start en dus is het een grotere uitdaging om de solubele niet-gevouwen translocatie-competente vorm van de proteïne te behouden. Van secretoire proteïnen wordt vaak gedacht dat ze snel vouwen en aggregatie-gevoelig zijn. Beide condities zijn niet compatibel met translocatie maar er zouden twee oplossingen zijn: 1) signaalpeptiden om vouwing te voorkomen of te vertragen en 2) chaperonne-proteïnen om aggregatie te vermijden. De solubele niet-gevouwen preproteïne wordt dan getarget het Sec translocase. Dit targetten wordt verzekerd door afzonderlijke bindingregio’s op SecA voor het signaalpeptide, het mature domein en chaperonne-proteïnen zoals SecB. Binding van het signaalpeptide op SecA verlaagt de activatie-energie van SecYEG-SecA en start de translocatiereactie. Het secretoire proteïne wordt dan geëxporteerd doorheen het geactiveerde SecY kanaal met energie afkomstig van de ATPase activiteit van SecA.
Secretoire proteïnen kunnen echter ook solubele niet-gevouwen translocatie-competente vormen aannemen en aanhouden in vitro voor een lange tijd zonder het signaalpeptide en chaperonne-proteïnen, wat een indicatie is dat de mature domeinen intrinsieke eigenschappen hebben ontwikkeld om niet-gevouwen en solubel te zijn. Dit, samen met de ontdekking van SecA-targeting signalen in het mature domein, zou onafhankelijke solubiliteit, targeting en zelfs translocatie - in proteïnelokalisatie (prl) Sec mutanten - van het mature domein mogelijk maken.
Aggregerende secretoire proteïnen - inherent, door vertraagde vouwing, hoge cel concentraties of cel stress - zijn afhankelijk van chaperonne-proteïnen om getarget te worden naar het Sec translocase in een solubele niet-gevouwen translocatie-competente vorm. Drie chaperonne-proteïnen in Escherichia coli zouden een rol spelen in de post-translationele route: trigger factor, SecB en SecA. Ik toon nu aan dat deze alle drie aggregatie van secretoire proteïnen vermijden in vitro. Ook kan hetzelfde secretoire proteïne gesolubiliseerd worden door verschillende chaperonne-proteïnen, wat zou kunnen betekenen dat er een in vivo netwerk is van chaperonne-proteïnen met een zekere redundantie, zoals het chaperonne-proteïnen netwerk dat verantwoordelijk is voor het vouwen van cytoplasmatische proteïnen. Verrassend is dat chaperonne-proteïnen niet alleen aggregerende secretoire proteïnen binden maar ook inherent solubele niet-gevouwen secretoire proteïnen die translocatie-competent zijn en dus eigenlijk onafhankelijk zijn van chaperonne-proteïnen voor targeting.
Een gedetailleerde analyse van één secretoir proteïne, proOmpA, onthulde dat trigger factor in zijn solubilisatie voorziet door te werken als een sterk-bindend holdase terwijl SecB werkt als een zwak-bindend holdase. Het TF:proOmpA complex wordt getarget naar SecYEG-gebonden SecA maar de Sec-gemedieerde translocatie start niet. SecB is nodig voor proOmpA translocatie: SecB laat proOmpA loskomen van de sterk-bindende holdase trigger factor en laat proOmpA translocatie doorgaan. Deze observaties leggen totaal nieuwe interacties bloot tussen de spelers van het Sec systeem en verklaren waarom een gebalanceerde TF/SecB ratio nodig is in vivo.
Na het overschrijden van het binnenste membraan moeten secretoire proteïnen ofwel hun niet-gevouwen vorm overwinnen om een functioneel proteïne in het periplasma te worden ofwel moeten ze hun route vervolgen om hun finale locatie in het buitenste membraan of de extracellulaire omgeving te bereiken. Hiervoor voorziet de cel enveloppe toegewijde routes met chaperonne-proteïnen en vouwfactoren die het secretoire proteïne daarin helpen.