Heterologous polygenic trait analysis using genomic degeneration mutagenesis of species hybrids

De globale gewaarwording omtrent de milieu-impact van fossiele brandstof-afgeleide producten in de energie- en transportsector vraagt om de ontwikkeling van milieuvriendelijke brandstofalternatieven. Een mogelijk alternatief voor benzine is bio-ethanol dat tot op heden vooral van suikerriet, maïs en tarwe geproduceerd werd. Aangezien dit voedselgewassen zijn, zijn lignocellulose afvalproducten en energiegewassen voorgesteld als alternatieven. De huidige tweede-generatie bio-ethanol prijs staat niet in competitiebeding met fossiele brandstof-afgeleide ethanol/benzine prijzen omwille van de hoge productiekosten. Dit is voornamelijk toe te schrijven aan de verschillende compositie van de twee soorten biomassa die gebruikt worden. Om lignocellulose biomassa af te breken zijn dure enzym cocktails nodig om de suikers vrij te zetten die gebruikt kunnen worden tijdens microbiële fermentatie.

Momenteel wordt voorspeld dat “geconsolideerde bioverwerking” (CBP) de meest kostenefficiënte productiemethode is. Hier produceert een micro-organisme de enzymen die nodig zijn om de suikers vrij te zetten en zet deze om in het gewilde eindproduct. Saccharomyces cerevisiae, beter bekend als bakkersgist, is een gegeerd micro-organisme voor ethanolproductie omwille van zijn hoge fermentatiesnelheid, zijn inhibitortolerantie (vooral ethanoltolerantie) en ethanol productiesnelheid. Een ongewenst compromis dat gemaakt moet worden tussen de optimale hydrolysetemperatuur van lignocellulolytische enzymen (45°-60°C) en de optimale fermentatietemperatuur van de meeste S. cerevisiae stammen (32°-35°C) leidt tot een hogere ethanolprijs. Het gebruik van thermotolerante gisten die efficiënt fermenteren bij 42°C en hoger zullen zowel de investerings- als de exploitatiekosten verlagen wat een lagere ethanolprijs tot gevolg zal hebben.

De meeste gistverbeteringstechnieken zijn tijdrovend en identificatie van causatieve (genetische) elementen is vaak moeilijk. In dit werk hebben we een techniek genaamd genoomtransformatie (WGT) toegepast om zowel snel superieure stammen te creëren als causatieve elementen te identificeren. Bij deze methode wordt het genoom DNA van een tolerante species geïsoleerd en getransformeerd in de gewenste gastheer. Het DNA van de thermotolerante gisten Kluyveromyces marxianus en Ogataea (Hansenula) polymorpha die kunnen groeien en fermenteren bij 45°C en hoger werd geïsoleerd. Dit DNA werd getransformeerd in de industriële, haploïde giststam ER18A HPH. Evaluatie van de transformanten op een vaste voedingsbodem bij temperaturen waarbij de ouderstam niet meer kon groeien en evaluatie in vloeibaar medium bij 42°C toonde aan dat alle transformanten beter presteerden dan ER18A HPH onder deze condities.

Om de genetische veranderingen te identificeren werden de transformanten KEA17, KEA24 en OEA28 samen met hun ouder onderworpen aan een complete genoomsequenering.  Vergelijking tussen de genoomsequenties van de transformanten en ER18A HPH onthulde dat er slechts een klein aantal mogelijk causatieve varianten geïntroduceerd werden. Gebruikmakend van de CRISPR/Cas9 technologie hebben we causatieve anticodonmutaties in KEA17 en KEA24 in een lysine en methionine tRNA, respectievelijk, geïdentificeerd als causatieve varianten. In OEA28 was een mutatie in de stam van de anticodonlus van een threonine tRNA verantwoordelijk voor de verbeterde fermentatie. Verder onderzoek naar het mechanisme achter de causaliteit van deze tRNA-veranderingen toonde aan dat TRT2, een essentieel gen dat het tRNAThrCGU codeert, cruciaal is tijdens fermentatie bij hoge temperatuur. In ER18A HPH bevat Trt2 een mutatie in de stam van de anticodonlus wat resulteert in een onstabiel tRNA bij hoge temperatuur. In OEA28 zorgde een complementaire mutatie in TRT2 voor herstel van de thermostabiliteit. KEA17 en KEA24 verwierven een anticodonmutatie in tK(CUU)K en EMT2, respectievelijk, wat zorgde voor een alternatieve bron van tRNAThrCGU. We hebben aangetoond dat al deze gemuteerde tRNA’s een functionele bron van tRNAThrCGU zijn en dat zulke mutaties blijkbaar vrij vaak voorgekomen zijn doorheen de evolutie.

Aangezien dit de eerste keer is dat er causatieve elementen geïdentificeerd zijn na WGT van een eukaryoot wilden we de resultaten vergelijken met een bestaande identificatiemethode. “Pooled-segregant genoomsequentie analyse” (PSS) is een vaak gebruikte methodologie om QTL’s te karteren en causatieve elementen van (de) ouderstam(men) te bepalen. We konden geen overlap aantonen tussen de “quantitative trait loci” (QTL’s) afkomstig van OEA28 en de mutaties geïdentificeerd bij het vergelijken van de genoomsequenties van OEA28 en ER18A HPH. In deze analyse hebben we zes QTL’s geïdentificeerd die afkomstig zijn van OEA28 en twee van BTC.1D, de tweede ouder.

In QTL1 op chromosoom XV resulteert het IRA2 allel van BTC.1D in superieure thermotolerantie. Het allel van OEA28 bevat een insertie van 8bp wat leidt tot een niet-functioneel proteïne. Uitwisseling van de IRA2 allelen tussen beide ouders met behulp van de CRISPR/Cas9 technologie toonde aan dat dit allel niet alleen een impact had op thermotolerantie, maar ook op de algemene groei en prestatie tijdens fermentaties bij alle temperaturen. Verder hebben we op chromosoom VII een intergenische regio afkomstig van BTC.1D, geïdentificeerd waar verschillende transcriptiefactorbindingsplaatsen gelegen zijn. Daarvan hebben we aangetoond dat ze de expressie van VRG4 en OST5 beïnvloeden, waarvan de genproducten betrokken zijn in mannosylatie en glycosylatie van proteïnen. Lagere expressie van beide genen resulteerde in een hogere fermentatiesnelheid en ethanolopbrengst bij 42°C. Dit is een van de eerste studies die, gebruikmakend van PSS, een intergenische regio in verband heeft gebracht met het fenotype. Identificatie van de overige QTL’s kan verder helpen de polygene basis van thermotolerantie op te helderen.

Verder onderzoek naar en ontwikkeling van WGT kan leiden tot een snellere verbetering van industriële S. cerevisiae stammen, o.m. voor productie van bio-chemicaliën. We hebben aangetoond dat zowel de combinatie van de snelheid van het verkrijgen van superieure stammen en de gelijktijdige identificatie van de onderliggende genetische varianten een voordeel is van WGT. Het verkrijgen van meer thermotolerante S. cerevisiae stammen die fermenteren bij temperaturen gelijkaardig aan de optimale temperatuur van de lignocellulolytische enzymen tijdens CBP zal resulteren in een goedkopere bio-chemicaliënproductie en dus de verschuiving naar een volledig bio-gebaseerde economie ondersteunen.