Inzicht in het kiemingsmechanisme van psychrotrofe groep II Clostridium botulinum (type E) sporen

Clostridium botulinum is een strikt anaerobe sporenvormende bacterie, en produceert het meest dodelijke toxine dat tot op heden gekend is, het botulinum neurotoxine (BoNT). Voedsel dat besmet is met (sporen van) deze pathogeen, kan daarom een groot gevaar vormen voor mens en dier. Bacteriële sporen zijn resistente structuren die zich in een metabolisch inactieve staat bevinden waardoor ze weerstandig zijn tegen allerlei stressfactoren zoals verhoogde temperatuur, droogte, gebrek aan nutriënten, UV, chemicaliën en zuurstof. Wanneer de condities gunstig zijn, kunnen zij uitgroeien tot vegetatieve cellen hetgeen gepaard gaat met toxineproductie. Vermits sporen een complex kiemingsproces moeten doorlopen vooraleer vegetatieve groei mogelijk is, is het in principe mogelijk om uitgroei en toxineproductie te voorkomen wanneer men sporenkieming kan verhinderen. Nochtans is het kiemingsproces van C. botulinum sporen nog maar zeer beperkt ontrafeld, voornamelijk omdat onderzoek met deze bacterie wordt bemoeilijkt door risico’s met betrekking tot bioveiligheid en bioterrorisme, en omdat strikt anaerobe werkomstandigheden noodzakelijk zijn om de bacterie te manipuleren. In deze doctoraatsthesis werd gefocust op psychrotrofe groep II C. botulinum (gIICb), een belangrijke doelwitpathogeen in minimaal behandelde gekoelde kant-en-klare voedingsmiddelen met een lange houdbaarheid. 

Om bioveiligheidsredenen werden eerst niet-toxigene mutanten geconstrueerd om het onderzoek naar het kiemingsproces te vergemakkelijken. Hiervoor werd een nieuwe deletiestrategie ontwikkeld waarmee vervolgens een ∆bontE mutant van C. botulinum NCTC 11219 werd verwezenlijkt. Het betreft de allereerste constructie van een deletiemutant in gIICb, een species groep die genetisch zeer moeilijk te manipuleren is en waarvoor de genetische toolbox nog zeer gelimiteerd is. Daarnaast werd ook een bontE insertiemutant gecreeërd in dezelfde parentale stam, via het ClosTron systeem. De groei- en sporulatiekarakteristieken alsook de hitteresistentie van de sporen van beide mutanten bleken grotendeels identiek te zijn aan de wildtype stam. Echter, ook enkele fenotypische verschillen werden waargenomen, en deze werden toegeschreven aan bijkomstige mutaties die geïdentificeerd werden via whole genome sequentieanalyse. Daarnaast kon uitgesloten worden dat de fenotypische verschillen gerelateerd zijn met de uitschakeling van BoNT-productie, doordat dezelfde atoxigene mutanten (via deletie en insertie) werden aangemaakt in een andere C. botulinum stam (NCTC 8266). Deze mutanten vertoonden geen verschil met de parentale stam, behalve een groeidefect bij verlaagde temperatuur voor de ClosTron mutant. De deletiemutanten van beide stammen bieden interessante perspectieven als veilige surrogaatorganismen voor gIICb in challenge testing van voedingsmiddelen.

In een tweede onderdeel van dit doctoraatsonderzoek, werd de sporenkieming in meer detail onderzocht. Hiervoor werd eerst het kiemingsinducered effect getest van het nutriëntmengsel L-alanine/L-lactaat/NaHCO3, hoge-druk-behandeling, calciumdipicolinaat (Ca2+-DPA) en dodecylamine. Op basis van het verlies van hitteresistentie en de vrijzetting van DPA werd geconcludeerd dat enkel de nutriënten en het surfactant dodecylamine sporenkieming induceerden. Dodecylamine-gekiemde sporen behielden echter hun refractiliteit in fasecontrastmicroscopie, hetgeen betekent dat ze geen water hebben opgenomen. Deze sporen waren ook enkel hittegevoelig in aanwezigheid van dodecylamine, en niet meer wanneer dodecylamine eerst werd weggewassen. Dit wijst er op dat dodecylamine geen echte kieming induceert.

Vervolgens werd het kiemingsinhiberend effect van vier natuurlijke antimicrobiële componenten (carvacrol, kaneelaldehyde, essentiële olie van wortelzaad en hop β-zuren) onderzocht. Hoewel natuurlijke componenten voornamelijk bestudeerd zijn voor hun groei-inhiberend effect, kan kiemingsinhibitie ook een bijdrage leveren tot de controle van sporenvormende bacteriën in voedingsmiddelen. De resultaten toonden dat de minimale concentratie nodig voor een significante vermindering van nutriëntkieming, vele malen lager ligt dan de minimale inhibitorische concentratie (MIC) op vegetatieve cellen voor carvacrol, kaneelaldehyde en essentiële olie van wortelzaad. Omdat relatief lage smaak- en geur-grenswaarden de applicatie van deze componenten in voeding vaak in de weg staan, zouden lagere concentraties dus mogelijk effectief kunnen zijn om gIICb sporenkieming te controleren.

In een meer mechanistisch gericht gedeelte, werden via deletieanalyse specifieke genen onderzocht die voorspeld worden een rol te spelen in het kiemingsproces van gIICb. De aanwezigheid van slechts één Ger-type germinant receptor, GerX3b, in gIICb stammen is atypisch omdat andere sporenvormers doorgaans meerdere dergelijke receptoren hebben. Het is bovendien intrigerend, omdat onduidelijk is hoe één receptor kan reageren met de vele verschillende nutriënten die kieming van gIICb sporen kunnen induceren. De gerBAC gencluster, die codeert voor de drie subeenheden van de GerX3b receptor, kon succesvol worden gedeleteerd. Kiemingsexperimenten met deze deletiemutant toonden aan dat de GerX3b receptor geen rol speelt in kieming geïnduceerd door verschillende nutriëntmengsels. Verder werd getracht twee voorspelde cortex hydrolasen, SleB and SleC, uit te schakelen met dezelfde deletiestrategie. Enkel voor SleB was dit succesvol. Sporen zonder SleB bleken nog steeds in staat om te kiemen, waaruit geconcludeerd kan worden dat dit enzym niet essentieel is om de cortex te hydrolyseren, zoals eerder voor SleB van C. difficile werd gerapporteerd. Een beperkte rol in sporenkieming kan echter niet worden uitgesloten omdat de kiemingsexperimenten een grote variabiliteit vertoonden.