Ontwikkeling van nanopartikels voor kankermedicatie aflevering en bio-sensing

Ondanks alle onderzoekinspanningen in de afgelopen decennia blijft kanker wereldwijd een van de belangrijkste doodsoorzaken. De resultaten in deze thesis representeren mijn aandeel in het fundamentele onderzoek naar chemotherapie. Hierin introduceer ik onder meer een vernieuwend medicatie aflevering systeem (Drug delivery system, DDS) dat verschillende voordelen biedt ten opzichte van huidige medicatie leverende nanocarriers. Dit in combinatie met een gedetailleerde studie naar de route en uiteindelijke bestemming van de medicatie, waarin ik innovatieve spectroscopische methoden ontwikkelde voor kanker gerelateerd onderzoek.

Functionalisatie van het nanopartikel oppervlak met polymeren wordt erg interessant bevonden in de context van ontwikkeling van DDSs omdat het een efficiënte en relatief eenvoudige manier biedt om specifieke opname van nanopartikels in tumorcellen mogelijk te maken. Technieken om de intracellulaire route, lokalisatie en retentie na opname van het nanopartikel te controleren zijn nog steeds beperkt, wat het bewerkstelligen van een hogere efficiëntie bij lagere dosis bemoeilijkt. In dit deel van de thesis wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor het ontwikkelen van efficiënte DDSs op basis van polymere dubbellaag-functionalisatie van mesoporeuze silica nanopartikels. Dit DDS combineert voor het eerst tumor-specifieke targeting en controle van de intracellulaire route, met name de ontsnapping van het nanopartikel uit het endosoom (endosomal escape). De actieve targeting werd bevestigd door de opnamesnelheid van de nanopartikels in respectievelijk kanker- en normale cellen te bepalen. De endosomale ontsnapping kon doorheen de tijd worden gevolgd door de nanopartikels te laden met een fluorofoor. Daarnaast toonde gecontroleerde medicatie levering en overlevingsanalyses aan dat deze hybride strategie erg efficiënt bleek in kanker cellen. Het hoge mortaliteitseffect, gecombineerd met specifieke targeting, de controle van de intracellulaire route (endosomale ontsnapping) en tijds-gecontroleerde medicatie afgifte maken dit hybride DDS uiterst veelbelovend voor het verbeteren van chemotherapie-efficiëntie en het tegengaan van bijwerkingen in vivo.

Tijdens in cellulo fluorescentie microscopie experimenten om de medicatie aflevering te volgen, werd geconstateerd dat de emissie van de fluorescente verbinding in de nucleus quenching onderging als gevolg van de intercalatie met het DNA, dit is problematisch voor de cellulaire detectie van de medicatie en het verder ontrafelen van zijn werkingsmechanisme. In dit deel van de thesis onderzocht ik deze nucleaire fluorescentie quenching door levende cellen te incuberen met de zuivere medicatie in suspensie (niet geladen in het DDS), wat bevestigde dat hetzelfde fenomeen zich voordeed wanneer de zuivere medicatie werd gebruikt.  Vervolgens stelde ik een alternatieve techniek voor om de cellulaire medicatie distributie te onderzoeken, met name Raman spectroscopie. Onze onderzoeksgroep rapporteerde eerder al een innovatieve tool voor intracellulaire studies die hoge spatiale resolutie toelaat gebaseerd op zilver nanodraad gemedieerde SERS endoscopie. In deze thesis perfectioneerde ik de probes, resulterend in een verhoogde nanodraad SERS activiteit die detectie van de medicatie in de nucleus mogelijk maakt. De verhoogde SERS activiteit werd bewerkstelligd door het vormen van goude nanostructuren op het sterk kristallijne oppervlak van de nanodraad. De verhoogde efficiëntie van deze nieuwe probe werd geverifieerd gebruik makende van een conventionele Raman reporter. In het kader van medicatie distributie detectie werden er SERS spectra verzameld van de nucleus van een met medicatie behandelde single-cel, wat het potentieel van deze techniek in intracellulaire bio-sensing applicaties, als alternatief voor fluorescentie microscopie, aantoonde.

Fundamentele studies met betrekking tot het kanker cel plasma membraan waren de laatste decennia wereldwijd erg populair in kanker onderzoek omdat het een van de basisconcepten is die nodig zijn voor de ontwikkeling van nieuwe kanker targeting technologieën. SERS spectroscopie heeft het potentieel om uit te groeien tot een ideale tool voor deze studies. Hoewel het produceren van deze SERS substraten tot op heden complex en tijdrovend is, ontwikkelde ik eenvoudige nieuwe manieren om SERS substraten te produceren die geschikt zijn voor cel membraan studies. Naar mijn mening kan deze techniek, mede door zijn eenvoud en snelheid, worden gebruikt door iedere onderzoeker en leiden tot belangrijke doorbraken in plasma membraan studies. In een eerste protocol worden gouden nanopartikels gesynthetiseerd op een polymeer oppervlak door het mengen van de reactie oplossingen op kamer temperatuur gedurende een aantal minuten. De adhesieve en flexibele kenmerken van het polymeer optimaliseren de efficiëntie van het substraat. In tegenstelling tot conventionele solide platformen, kan de polymere film zich hechten aan een gewenst oppervlak en daar de SERS activiteit verhogen. De versterkte plasmon-activiteit werd geverifieerd door detectie van SERS signalen van pesticiden op de schil van een appel, wat aantoonde dat dit substraat een goede kandidaat is voor SERS-sensing van plasmon-inactieve oppervlakken zoals het plasma membraan.

Omdat zilver en goud verschillen in het hun optische kenmerken, kan er, afhankelijk van de applicatie, voor gouden of zilveren nanopartikels geopteerd worden. Zilver heeft echter de hoogste SERS activiteit, in het bijzonder bij frequenties in de regio van zichtbaar licht, en wordt daarom het meestal verkozen boven goud. In het laatste deel presenteer ik een snel syntheseprotocol voor zilveren nanopartikels, gelijkend aan dat van gouden nanopartikels, op dezelfde polymere film en optimaliseer ik de substraten door de depositie van een gouden film. De gouden film kan oxidatie verhinderen en de biocompatibiliteit verhogen. Deze hybride structuur werd opnieuw getest als SERS substraat. De SERS-gevoeligheid van zilver werd aangetoond door pH-metingen en de bescherming tegen oxidatie door de gouden laag werd gedemonstreerd door SERS metingen uit te voeren op verouderde substraten. Deze hybride probes kunnen uiterst geschikt zijn voor cellulaire studies vanwege de combinatie van de hoge efficiëntie van zilver en de relatieve biocompatibiliteit van goud.