Ontwikkeling en validatie van sneltesten om infliximab dalspiegels en antilichamen tegen infliximab kwantitatief te bepalen.

De ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, de twee voornaamste vormen van inflammatoire darmziekten (IDZ), zijn chronische, inflammatoire ziekten van het gastro-intestinaal stelsel waarin ziekteopstoten afwisselen met periodes van remissie. Ze komen voor in ongeveer 0.5% van de Westerse bevolking en brengen een levenslange belasting van de patiënt en de gezondheidszorg teweeg. De behandeling van deze ongeneeslijke ziekten werd aanzienlijk verbeterd dankzij de introductie van biologische geneesmiddelen, zoals infliximab, wat leidde tot een verhoogde levenskwaliteit van deze patiënten en een gedaald aantal hospitalisaties en operaties. Helaas geniet niet iedereen van éénzelfde therapeutisch effect; sommige patiënten ondervinden geen meerwaarde van deze therapie, terwijl anderen respons verliezen na verloop van tijd. Deze laatsten ontwikkelen vaak anti-infliximab antilichamen (ATI) doordat het immuunsysteem infliximab als een lichaamsvreemd proteïne beschouwt. ATI neutraliseren het therapeutisch effect van infliximab en worden sneller geëlimineerd door het lichaam.

Recent werd therapeutische geneesmiddelmonitoring (TGM) van infliximab en ATI geïntroduceerd als een objectief middel om de behandeling van patiënten met IDZ te optimaliseren. Lage dal concentraties van infliximab en de aanwezigheid van ATI werden immers gerelateerd aan verlies van respons. Helaas vertoont de huidige generatie testen voor het bepalen van infliximab en ATI grote verschillen in kwantificering en missen ze vaak sensitiviteit en specificiteit. Een ander nadeel van de huidige testen is hun lange executietijd en nood aan gespecialiseerde laboratoriumfaciliteiten en ervaren personeel. Alles te samen kan dit leiden tot een vertraagde of zelfs verkeerde instelling van de juiste therapie en een inefficiënt gebruik van financiële middelen. In dit doctoraatsproject werd daarom vooropgesteld om de huidige generatie testen te verbeteren en de mogelijkheden van andere testplatformen te onderzoeken om zo de implementatie van TGM in de kliniek te bevorderen.  

Introductie van monoklonale antilichamen in de infliximab en ATI ELISA

Als eerste doel van dit doctoraatsproject wilden we een panel van monoklonale anti-infliximab antilichamen (MA-IFX) genereren die gebruikt konden worden in de infliximab en ATI ELISA. Monoklonale antilichamen hebben het voordeel dat ze met hoge specificiteit en affiniteit binden aan slechts één bindingssite van hun target en zo mogelijke kruisreactiviteit met gelijkaardige proteïnes vermijden. Bovendien kunnen ze makkelijk gereproduceerd worden waardoor test standaardisering en harmonisering mogelijk wordt. Uit 55 gegenereerde MA-IFX, werd uiteindelijk MA-IFX6B7 geselecteerd als vervanger van het polyklonale antilichaam (pAb) voor de detectie van infliximab in de infliximab ELISA (Hoofdstuk II). De MA-gebaseerde ELISA detecteert specifiek infliximab en niet adalimumab, golimumab of humane immunoglobulines. Meerdere vergelijkende studies werden uitgevoerd met de nieuwe MA-gebaseerde infliximab ELISA, waarin een uitstekende overeenkomst met onder andere de pAb-gebaseerde ELISA en andere (commercieel) beschikbare testen werd aangetoond. Vervolgens vervingen we de polyklonale antilichaamkalibrator in de ATI ELISA door MA-IFX10F9, dewelke dienst kan doen als universele kalibrator voor de harmonizering van ATI testen (Hoofdstuk III). Hiernaast werd de ATI ELISA geoptimaliseerd om de gevoeligheid (4-maal) en specificiteit van de test te verhogen. Als gevolg hiervan detecteerde de test ATI vroeger op in bijna de helft van het aantal geanalyseerde ATI positieve patiënten, terwijl vals positieve testresultaten werden geëlimineerd.

Ontwikkeling en evaluatie van geneesmiddeltolerante anti-infliximab antilichaamtesten

Als tweede doel beoogden we een ATI ELISA te ontwikkelen die ATI kan detecteren in de aanwezigheid van infliximab, ook wel een geneesmiddeltolerante test genoemd. De eerste generatie ATI testen liet dit immers niet toe. Twee verschillende benaderingen werden met succes uitgetest. De eerste methode omvatte een staalvoorbereidingsstap, een eenvoudige additie aan het protocol van de geneesmiddelgevoelige ATI ELISA die de geneesmiddeltolerantie reeds verhoogde tot 2.5 µg/mL infliximab (Hoofdstuk IV). De tweede benadering, oftewel “ACE” methode, hield twee dissociatiestappen in zuur midden in alsook een verwijdering van de overmaat infliximab en verhoogde de geneesmiddeltolerantie tot minstens 10 µg/mL infliximab. Beide testen verhoogden de detectie van ATI in patiëntenstalen met een detecteerbare infliximabconcentratie. In een post-hoc analyse van een subpopulatie patiënten uit de TAXIT-studie (Hoofdstuk V), detecteerde de ACE ELISA ATI in 41% van de patiënten gedurende heel het verloop van de studie (bij screening, na optimalisatie en aan het einde van de studie), in tegenstelling tot de geneesmiddelgevoelige test die geen enkele ATI meer detecteerde in patiëntenstalen genomen na optimalisatie.

We konden echter weinig klinische relevantie toekennen aan de ACE ELISA. Gedetecteerde ATI in de geneesmiddeltolerante test, maar niet in de geneesmiddelgevoelige test, waren gewoonlijk aanwezig in een lage concentratie en verdwenen vaak gedurende TAXIT, terwijl ATI die gedetecteerd werden in de geneesmiddeltolerante en –gevoelige ELISA meestal in een hoge concentratie aanwezig waren en gedurende heel de TAXIT-studie aangetoond konden worden. In Hoofdstuk VI werd de geneesmiddeltolerante ACE ELISA toegepast op een prospectieve, observationele studie in patiënten waarin infliximab inductietherapie werd opgestart en eerder nog geen biologische therapie hadden gekregen. Naast een verhoogde detectie van ATI in de geneesmiddeltolerante test, ging de detectie van ATI in de geneesmiddeltolerante test altijd vooraf aan detectie in de geneesmiddelgevoelige test, maar werden echter niet alle patiënten later positief in de geneesmiddelgevoelige test. In twee van deze patiënten werden wel ATI-gerelateerde nevenwerkingen geïdentificeerd die misschien voorkomen konden worden indien deze ATI vroeger konden opgespoord worden.

Ontwikkeling en validatie van infliximab sneltesten

Tenslotte beoogden we de infliximab ELISAs te transfereren naar alternatieve platformen die toelaten infliximab op een snelle en toegankelijke manier te bepalen. In dit perspectief werd optische vezel-oppervlakte plasmon resonantie (“fiber optic-surface plasmon resonance”, FO-SPR) en een laterale flow-gebaseerde assay (LFA) geëvalueerd voor kwantificatie van infliximab. In FO-SPR is de weerkaatsing van zichtbaar licht op een dunne gouden laag gerelateerd aan de moleculaire interacties op het gouden contactvlak. Een FO-SPR bioassay werd ontwikkeld met de antilichaamcombinatie MA-IFX20G2/MA-IFX3D5 en zorgde voor kwantificatie van infliximab in het ng/mL bereik, binnen 20 minuten. Analyse van patiëntenstalen toonde een uitstekende overeenkomst met de infliximab ELISA aan. In co-ontwikkeling met R-Biopharm AG (Darmstadt, Duitsland) werd de toepasbaarheid van LFA voor infliximab detectie onderzocht met MA-IFX6B7, wat uiteindelijk leidde tot een CE-gemarkeerde test die werd gevalideerd in Hoofdstuk VI. Het principe van LFA steunt op dunne laag chromatografie gecombineerd met ELISA; het meeste bekende voorbeeld van een LFA is de zwangerschapstest. In LFA, volledig uitgevoerd na 20 minuten, leidt de aanwezigheid van infliximab tot een rode band ter hoogte van de testlijn, waar infliximab bindt aan geïmmobiliseerd MA-IFX6B7. Analyse van meer dan 200 patiëntenstalen toonde een uitstekende overeenkomst aan met de infliximab ELISA.

Dit doctoraatsproject presenteert nieuwe bioassays met een uitstekende analytische performantie voor de kwantitatieve bepaling van infliximab en ATI. Allereerst elimineerde de introductie van MA-IFX de specificiteits- en reproduceerbaarheidsproblemen die onafscheidelijk verbonden waren met de eerste generatie testen. Bovendien ondersteunen deze MA-IFX harmonisering van de testen, doordat hun continue productie kan gegarandeerd worden. Vervolgens werden geneesmiddeltolerante testen ontwikkeld die de detectie van ATI toelaten in de aanwezigheid van infliximab. Tot nu toe konden we echter slechts een geringe klinische relevantie toewijzen aan deze testen. Tenslotte hebben we alternatieve infliximab testen ontwikkeld met een verkorte analysetijd en verhoogde toegankelijkheid zodat deze makkelijker in een ziekenhuis of infusiecenter geïmplementeerd kunnen worden. We hopen daarom dat deze nieuwe en innovatieve bioassays hun steentje kunnen bijdragen aan een verbeterde behandeling en verhoogde levenskwaliteit van patiënten met inflammatoire ziekten.