De ontwikkeling van een geavanceerd fluorescent modelsysteem voor het bestuderen van de replicatie van retrovirussen op het niveau van een enkel virus.

Het humaan immuundeficiëntie virus (HIV) is een lentivirus dat behoort tot de familie van de Retroviridae en veroorzaakt het acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). In 2009 werd het aantal met HIV geïnfecteerde individuen op meer dan 33.3 miljoen geschat (www.unaids.org) en jaarlijks komen hier 2 tot 3 miljoen besmettingen bij. De huidige behandeling van HIV infectie bestaat uit een combinatietherapie van antiretrovirale middelen die de virusreplicatie efficiënt en langdurig onderdrukt. Echter, wegens de quasi onvermijdelijke ontwikkeling van resistentie tegen de bestaande antivirale cocktails, en het uitblijven van een doeltreffend vaccin, blijft de zoektocht naar nieuwe remmers en nieuwe doelwitten voor therapie van het allergrootste belang.

Gezien HIV slechts een beperkte genomische capaciteit bezit is het virus aangewezen op het gebruik van cellulaire eiwitten, cofactoren genoemd, voor het voltooien van de replicatiecyclus. Het laboratorium voor moleculaire virologie en gentherapie doet onderzoek naar nieuwe cellulaire cofactoren van HIV integrase, het enzym dat het virale cDNA stabiel integreert in het genoom van de geïnfecteerde cel. Na reverse transcriptie van het virale RNA naar cDNA in het cytoplasma van de gastheercel associeert het virale DNA met een aantal virale en cellulaire eiwitten ter vorming van het pre-integratiecomplex (PIC), en wordt dan door het kernmembraan naar de nucleus van de gastheercel getransporteerd. Dit transport wordt gemedieerd door het cellulaire karyopherine transportine-SR2 (TRN-SR2). In de nucleus wordt het PIC aan het chromatine verankerd door de binding van het cellulaire eiwit LEDGF/p75 (lens epithelium-derived growth factor) aan enerzijds integrase en anderzijds het doelwit-DNA. Vervolgens wordt het viraal DNA stabiel geïntegreerd in het genoom van de gastheer door de katalytische activiteit van IN, waarna nieuwe viruspartikels gevormd kunnen worden.

Interacties tussen deze cellulaire cofactoren en virale eiwitten vormen aantrekkelijke doelwitten voor de ontwikkeling van nieuwe antiretrovirale middelen. Zowel LEDGF/p75 als TRN-SR2 worden nu wereldwijd bestudeerd door verschillende onderzoekslaboratoria. In 2010 werd een nieuwe klasse van antivirale moleculen gepubliceerd, de LEDGINs, die de eiwit-eiwit interactie tussen LEDGF/p75 en HIV IN verbreken en een sterke antivirale activiteit vertonen in celcultuur. Momenteel worden de LEDGINs in samenwerking met Pfizer verder ontwikkeld voor potentieel klinisch gebruik.

Niettegenstaande het ontegensprekelijk bewezen is dat TRN-SR2 een duidelijke rol speelt in de nucleaire translocatiestap, is een directe interactie van dit eiwit met IN, in de context van het PIC in de geïnfecteerde cel nog niet aangetoond. Aangezien dit bijna onmogelijk is te bestuderen met standaard moleculaire technieken, is er een nood aan een robuuste manier om eiwit-eiwit interacties van HIV op single-virus en/of single-PIC niveau te bestuderen in levende cellen gedurende de vroege stappen van de replicatiecyclus van het virus.

De onderzoeksgroep voor fotochemie en spectroscopie heeft als expertise het ontwikkelen en toepassen van kwantitatieve fluorescentietechnieken, meer bepaald technieken voor single-molecule spectroscopie en microscopie. In dit project willen we dan ook een methode ontwikkelen en optimaliseren om via fluorescentiebeeldvorming de vroege stappen van de virale replicatie op een kwantitatieve manier, op single-molecule niveau, in geïnfecteerde cellen te kunnen bestuderen. De beoogde technieken moeten ons in staat stellen de stoichiometrie en affiniteit van eiwit-eiwit interacties tussen virale en cellulaire factoren te karakteriseren in tijd en ruimte, wat cruciale informatie zal opleveren over de interacties van virale eiwitten met cofactoren zoals TRN-SR2 en LEDGF/p75 in de zoektocht naar nieuwe inhibitoren van HIV replicatie.