Inzicht in de fosforylatie van het influenza virus nucleoproteïne en zijn rol in virus replicatie: de basis voor een innovatieve antivirale strategie

Influenza infecties veroorzaken een aanzienlijke medische en sociaal-economische last. Humane influenza A- en B-virussen resulteren elk jaar in miljoenen gevallen van ernstige luchtwegaandoeningen met soms dodelijke afloop. Om de zoveel tijd ontstaat een pandemie wanneer een zoönotisch influenza A virus zich vestigt in de menselijke bevolking. Antivirale middelen zijn cruciaal voor behandeling en preventie van influenza, vooral bij kwetsbare bevolkingsgroepen zoals ouderen. Op dit moment zijn neuraminidase (NA)-remmers de enige geneesmiddelenklasse die wereldwijd beschikbaar is, maar resistentie ertegen is een ernstig probleem. Nieuwe remmers met een volledig ander werkingsmechanisme zijn absoluut noodzakelijk. Naast strategieën die rechtstreeks gericht zijn tegen het virus, dienen gastheercelfactoren beschouwd te worden die veel minder gevoelig zijn voor resistentie ontwikkeling. Binnen dit plethora aan mogelijkheden, hebben we ons hier gericht op receptor tyrosine kinasen (RTK), een klasse van proteïne kinasen waarvoor in het afgelopen decennium verschillende therapeutica zijn ontwikkeld.

In hoofdstuk 2 hebben we eerst een bibliotheek van 276 proteïne kinaseremmers geëvalueerd op anti-influenzavirus activiteit in Madin-Darby Canine Kidney cellen. De RTK remmer Ki8751 kwam naar voren als een robuuste remmer van de replicatie van influenza A- en B-virussen, in staat om de viral load met een factor 3-log10 te reduceren aan niet-toxische concentraties. Gedetailleerd mechanistisch onderzoek wees uit dat Ki8751 interfereert met de PDGFRβ-gemedieerde internalisatie van influenzavirus, wat wijst op een nauwe wisselwerking tussen het virus en dit specifiek RTK. Door gebruik van twee verwante CHO-cellijnen toonden we aan dat deze route van virus internalisatie afhankelijk is van op de celmembraan aanwezige gangliosiden. Het virus dat de cel binnendringt bleek de voorkeur te geven aan GM3-positieve boven GM1-positieve ‘lipid rafts’, wat consistent is met een stimulerend effect van GM3 op de PDGFRβ-signalering en op internalisatie van het virus via deze route. Onze intrigerende observatie dat gefosforyleerd PDGFRβ desialylering ondergaat door het virale NA, zou kunnen duiden op een nog onbekende functie van NA bij de virusopname. De PDGFRβ-gemedieerde opname van influenzavirus viel samen met activering van de Raf/MEK/Erk-signaal pathway, maar niet van PI3K of fosfolipase C-γ.

In hoofdstuk 3 hebben we de rol van RTKs in latere stadia van de replicatie uitgediept, nadat we hadden opgemerkt dat een VEGFR2-getransfecteerde CHO-cellijn hogere niveaus van viraal RNA synthetiseert, een effect dat onafhankelijk bleek van celmembraan-geassocieerd VEGFR2. Het stimulerende effect van VEGFR2 op de virale RNA-synthese was het sterkst op 6 uur p.i. en viel samen met versnelde nucleaire export van de virale ribonucleoproteïne (vRNP) complexen. We opperen dat nucleair VEGFR2 de fosforylatiestatus van het virale nucleoproteïne (NP) zou kunnen veranderen, bijvoorbeeld ter hoogte van de residus Tyr296/Ser297, en zo de vRNPs voor nucleaire export zou kunnen ‘primen’. Aangezien de CHO-cellijn echter een onvolledige vorm van VEGFR2 bleek te bevatten (d.w.z. zonder het kinasedomein), lijkt de medewerking van een andere RTK nodig om de NP-fosforylatiestatus te wijzigen en de replicatie van influenzavirus te verhogen.

Tot besluit, onze studie toont aan dat cellulaire RTKs een rol spelen in twee fasen van de influenzavirus replicatie: internalisatie en nucleaire export. Om de gastheercel binnen te dringen, maakt het virus efficiënt gebruik van de PDGFRβ/GM3-gemedieerde signaal pathway, waarbij naast het virale HA ook het NA schijnt tussen te komen. Deze nauwe associatie met PDGFRβ biedt de mogelijkheid om het virus te onderdrukken met PDGFRβ remmers zoals Ki8751 of meer geavanceerde klinische kandidaten. Om robuuste activiteit tegen influenza A- en B-virussen te bekomen, in combinatie met een gunstig therapeutisch venster, is het belangrijk om geïnhaleerde formuleringen van PDGFRβ blokkers verder te bestuderen en te ontwikkelen. Daarnaast tonen onze bevindingen aan dat het virale nucleaire export gereguleerd wordt door RTK pathways die in de kern werken, zoals VEGFR2-geassocieerde kinasen of fosfatasen. Dit houdt naar alle waarschijnlijkheid een wijziging in van de NP-fosforylatiestatus. Vermits meerdere RTK remmers al goedgekeurd of in klinische ontwikkeling zijn, kan combinatie van deze therapeutica met direct werkende antivirale middelen een waardevolle strategie zijn om grieptherapie effectiever te maken of het probleem van resistentie tegen antivirale middelen het hoofd te bieden.