Titel Promotor Affiliaties "Korte inhoud" "Entry inhibitoren voor humaan respiratoir virus SARS-CoV-2" "Kurt Vermeire" "Laboratorium Klinische en Epidemiologische Virologie (Rega Instituut), Laboratorium Virologie en Chemotherapie (Rega Instituut)" "Ondanks het duidelijke succes van de toegediende COVID-19-vaccins, kunnen we de verspreiding van SARS-CoV-2 nog steeds niet beheersen, zoals blijkt uit de huidige circulatie van de zeer besmettelijke Omicron-variant. Dit benadrukt de noodzaak om door te gaan met de ontwikkeling van effectieve breedspectrum antivirale middelen die kunnen worden gebruikt om de virale verspreiding snel te verminderen wanneer zich een epidemie met een (her)opkomend virus voordoet. Kandidaat-SARS-CoV-2-remmers moeten een brede activiteit vertonen tegen verschillende virusvarianten in verschillende celtypen, en moeten onafhankelijk van de toegangsroute activiteit behouden. Een klasse van potentiële SARS-CoV-2-antivirale middelen zijn entry inhibitoren en staan centraal in dit doctoraatswerk.Het algemene doel van dit doctoraatswerk is het bestuderen en ontwikkelen van entry inhibitoren voor SARS-CoV-2.Ten eerste hebben we methoden geoptimaliseerd om SARS-CoV-2-virusdeeltjes en met virus geïnfecteerde cellen in vitro (WP1) te detecteren. Een duplex RT-qPCR werd in huis ontworpen voor de gevoelige detectie van viraal RNA van SARS-CoV-2-deeltjes van verschillende varianten. Daarnaast hebben we flowcytometrie toegepast om SARS-CoV-2 op celniveau te detecteren.Het tweede doel was om cellulaire assays te ontwikkelen om te screenen op antivirale middelen die cellulaire entry van SARS-CoV-2 voorkomen. Op basis van de interessante kenmerken (d.w.z. snelle en volledige CPE) van de U87-cellen die in eerder HIV-werk werden gebruikt, hebben we de toepasbaarheid onderzocht van het gebruik van U87-cellen voor anti-coronavirus-assays (WP2). Vervolgens hebben we een op impedantie gebaseerde fusie assay (WP3) ontwikkeld. Aangezien de fusie van virale en celmembranen de vorm en grootte van de cel verandert, hebben we de mogelijkheden onderzocht om de fusie-gebeurtenis in realtime te volgen.Ten derde willen we potentiële SARS-CoV-2 entry-remmers identificeren en hun werkingsmechanisme in meer detail analyseren (WP4). We hebben met succes onze nieuw ontwikkelde assays gebruikt om de lectine, UDA, te screenen en te profileren als entry inhibitor voor SARS-CoV-2." "Karakterisatie van Chikungunya virus-gastheer eiwit interacties betrokken in virus entry" "Xaveer Van Ostade, Kevin Ariën" Virologie "Arboviruses require a hematophagous arthropod vector for their transmission to vertebrates. This peculiar mode of transmission involves a complex and as yet obscure interaction between the virus, the vector and the vertebrate. The alphavirus Chikungunya has lost the requirement for enzootic amplification and now causes extensive epidemics in tropical urban centers, as well as in more temperate regions as a result of the expanding habitat of anthropophylic mosquitoes like Aedes aegypti and Aedes albopictus. In 2014, approximately 1.5 million Chikungunya cases were reported in the Caribbean and the Americas. Endogenous transmission was also reported in Montpellier, France. We propose a systems biology approach to disentangle the earliest steps in the Chikungunya replication cycle, i.e. viral attachment and entry into a host cell. This process is poorly defined for alphaviruses and the receptor for Chikungunya entry is elusive. The results from this study will contribute significantly to the understanding of the initial steps of the Chikungunya replication cycle and will yield novel insights for alphavirus inhibition strategies. Furthermore, the generic platform presented here allows to study host-pathogen and vector-pathogen interactions of other viral and non-viral agents." "Mechanistische studie van virus entry en replicatie. Een fundamentele benadering voor de ontwikkeling van nieuwe en specifieke antivirale chemotherapeutica." "Jan Balzarini" "Laboratorium Virologie en Chemotherapie (Rega Instituut)" "Entry van feliene coronavirussen in hun primaire doelwitcellen" "Hans Nauwynck" "Vakgroep Translationele Fysiologie, Infectiologie en Volksgezondheid, Vakgroep Biomedische Moleculaire Biologie" "In dit onderzoeksproject zullen de doelwitcellen van de feliene coronavirussen ter hoogte van de intestinale mucose gekarakteriseerd worden en zal de replicatie in deze cellen bestudeerd worden. Dit zal gebeuren aan de hand van een intestinaal mucosa explantmodel. Vervolgens zal de entry van deze virussen geanalyseerd worden en zal een verklaring gezocht worden voor de verschillen tussen FIPV en FECV." "Dengue virus infectie van endotheelcellen: Pathogenese en glycosaminoglycanen als antiviraal doelwit" "Sandra Liekens" "Laboratorium Virologie en Chemotherapie (Rega Instituut)" "Dengue virussen (DENV) zijn positief-georiënteerde enkelstrengige RNA virussen die tot de familie van de Flaviviridae behoren, samen met andere belangrijke humane pathogenen (waaronder gele koorts virus en West-Nijl virus). Dengue wordt momenteel beschouwd als de belangrijkste virale aandoening in mensen die door geleedpotigen wordt overgedragen. Vier genetisch verschillende, maar serologisch verwante serotypes (DENV 1-4) worden overgedragen op de mens door muggen van het genus Aedes in meer dan 100 landen in tropische en subtropische gebieden in Zuidoost-Azië, Amerika en Afrika. De voornaamste dengue vector is Aedes aegypti, terwijl Aedes albopictus fungeert als een secundaire vector. Meer dan 2,5 miljard mensen leven in gebieden die getroffen worden door dengue en men schat dat jaarlijks 390 miljoen DENV infecties optreden. Het DENV ziektebeeld varieert van een milde, koortsige aandoening die dengue koorts (DK) wordt genoemd tot een ernstige en mogelijks levensbedreigende aandoening, genaamd dengue hemorrhagische koorts (DHK)/dengue shock syndroom (DSS). De symptomen van DK omvatten plotse, hoge koorts (>39°C), hoofdpijn, misselijkheid, overgeven, uitslag en spier- en gewrichtspijnen; terwijl DHK/DSS gekarakteriseerd wordt door verhoogde vasculaire permeabiliteit, die resulteert in plasmaverlies, trombocytopenie en coagulopathie. Ondanks jarenlang onderzoek, werden de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor het DENV-geïnduceerde plasmaverlies nog niet opgehelderd. Het gemak waarmee bloedstalen verzameld worden heeft onderzoekers ertoe aangezet om te focussen op de rol van immuuncellen en oplosbare mediatoren. Deze studies hebben geleid tot de identificatie van dendritische cellen, monocyten en macrofagen als de voornaamste DENV doelwitcellen. Hoewel endotheelcellen (EC) de binnenste laag van de bloedvaten aflijnen en de uitwisseling van gassen, vloeistoffen en opgeloste stoffen tussen de bloedvaten en de omringende weesfels dirigeren, werd een actieve deelname van het endotheel in de pathogenese van DENV slechts recent in overweging genomen. DENV antigenen en viraal RNA, indicatief voor virusreplicatie, werden aangetoond in EC in verscheidene organen (long, milt, lever, hart en hersenen) met behulp van immunohistologische technieken en in situ hybridisatie. Daarom was het doel van deze studie om (i) de infectie van microvasculaire endotheelcellen door DENV te onderzoeken, (ii) de respons van verschillende EC types na infectie door DENV 1-4 te vergelijken en (iii) inhibitoren van DENV infectie van EC te evalueren. In Hoofdstuk 2 hebben we onderzocht of primaire microvasculare EC (HMVEC-d) en de geïmmortaliseerde EC lijn HMEC-1 geïnfecteerd kunnen worden door DENV, omdat DENV-geïnduceerd plasmaverlies optreedt ter hoogte van het microvasculaire endotheel. We toonden voor het eerst aan dat microvasculaire EC permissief zijn voor infectie door en replicatie van DENV, hoewel de goed beschreven DENV receptoren DC-SIGN (op dendritische cellen) of de mannose receptor and Fcγ-receptor (op monocyten/macrofagen) afwezig zijn op deze cellen. De bevinding dat infectie van EC door DENV geblokkeerd kan worden met natuurlijke glycosaminoglycanen (GAG), inclusief heparine en heparaan sulfaat, suggereerde dat heparaan sulfaat-bevattende proteoglycanen (HSPG) betrokken zijn in de infectie van EC. Met behulp van flow cytometrie toonden we aan dat HSPG sterk tot expressie worden gebracht op deze cellen en dat een sterke afname in het aantal geïnfecteerde cellen werd waargenomen wanneer heparaan sulfaat enzymatisch werd verwijderd. Deze resultaten tonen aan dat  infectie van ECs door DENV-2 gemedieerd wordt door HSPG. De klinische toepassingen van heparine en heparine analogen zijn echter beperkt door de anticoagulerende activiteit van deze moleculen. Daarom werd de antivirale activiteit van gesulfateerde derivaten van het K5 capsulair polysaccharide van Escherichia coli tegen DENV-2 in HMEC-1 en HMVEC-d cellen onderzocht. Het K5 polysaccharide heeft dezelfde structuur als de biosynthetische precursor van heparine maar vertoont geen anticoagulerende activiteit. We vonden een sterk antiviraal effect  voor de hoog gesulfateerde K5-OS(H) en K5-N,OS(H) derivaten met EC50 waarden in het nanomolaire bereik. ‘Time-of-addition’ en aanhechting/entry assays toonden aan dat deze moleculen de vroege stappen in de infectiecyclus van DENV inhiberen. Verder toonden we aan dat de K5 derivaten de fusie van C6/36 muggencellen inhiberen door de interactie met het DENV envelop (E) eiwit. Met behulp van ‘surface plasmon resonance’ (SPR) analyses toonden we de binding van K5-OS(H) en K5-N,OS(H) op het DENV E protein domein III (E DIII) aan, dat het receptor bindend domein van DENV bevat. Bovendien verhinderden de sterk gesulfateerde K5 derivaten de binding van het E DIII op geïmmobiliseerd heparine, hetgeen het infectieproces van microvasculaire EC door DENV nabootst. Ten slotte inhibeerden K5-OS(H) en K5-N,OS(H) de infectie van dendritische cellen door DENV. Samengevat tonen deze resultaten aan dat sterk gesulfateerde K5 derivaten kunnen beschouwd worden als een nieuwe klasse van antivirale middelen tegen DENV, hoewel hun activiteit tegen de andere DENV serotypes nog dient bevestigd te worden. In Hoofdstuk 3 werd de antivirale activiteit van chemokine peptides onderzocht. Aangezien DENV infectie van EC gemedieerd wordt door HSPG, zouden positief geladen peptiden in competitie kunnen treden voor de binding op heparaan sulfaat. Chemokines zijn afhankelijk van de binding op GAGs op EC voor het creëren van een chemokine gradient, die vereist is voor de recrutering van immuuncellen naar de plaats van productie. De binding van chemokines op GAGs wordt gemedieerd door clusters van basische aminozuren in de carboxy-terminus van de chemokines en de negatief geladen sulfaat/carboxylgroepen in HSPGs. De CXC chemokines, CXCL9 en CXCL12γ, hebben een karakteristieke basische carboxy-terminus and bevatten meerdere hepaan sulfaat bindingsmotieven. Daarom werd eerst de binding van verschillende COOH-terminale CXCL9 en CXCL12γ peptides op heparine gekarakteriseerd met behulp van SPR analyse. Deze data toonden aan dat de positief geladen peptides hoge bindingsaffiniteit vertonen voor geïmmobiliseerd heparine, met uitzondering van CXCL9(86-103) waarin 2 vermoedelijke HS bindingsplaatsen ontbreken. Bovendien waren de CXCL9 en CXCL12γ peptides in staat om in competitie te treden voor de binding op heparine met CXCL8, een sterke heparine binder. Omdat voor verschillende virussen werd aangetoond dat ze HSPG gebruiken als aanhechtingsreceptor op de doelwitcellen, werd een kleine antivirale screen uitgevoerd met de chemokine peptides. In deze screen vertoonden de chemokine peptides antivirale activeit bij micromolaire concentraties tegen herpes simplex virus type 1 (HSV-1), respiratoir syncytium virus (RSV) en DENV-2. SPR analyse werd gebruikt om de competitieve binding tussen de CXCL9 peptides en DENV E DIII op geïmmobiliseerd heparine te bestuderen. Hierbij werd aangetoond dat het CXCL9(74-103) peptide sneller bindt op heparine dan DENV E DIII en als dusdanig de interactie tussen DENV E DIII en heparine  verhindert, wat de anti-DENV-2 activiteit van het peptide kan verklaren. Deze resultaten suggereren verder dat de positief geladen carboxy-terminale CXCL9 en CXCL12γ chemokine peptides kunnen gebruikt worden als ‘lead compounds’ voor de ontwikkeling van een nieuwe categorie van antivirale middelen die gericht zijn op de interactie tussen virussen en HPSG. In Hoofdstuk 4 hebben we getracht om de effecten van DENV 1-4 infectie te vergelijken in  EC van verschillende oorsprong. Tegenstrijdige resultaten werden gerapporteerd inzake de infectiegraad en de respons van EC na DENV infectie. Bovendien bemoeilijkt het gebruik van EC van verschillende oorsprong het vergelijken van de bekomen resultaten. De meeste data werden bekomen met DENV-2, en in mindere mate met DENV-4, terwijl slechts enkele studies het effect van DENV-1 of -3 rapporteerden. Daarom infecteerden we de microvasculaire cellijn HMEC-1 en de primaire microvasculaire (HMVEC-d) en macrovasculair (HUVEC) EC met stammen van de vier DENV serotypes: DENV-1 Djibouti, DENV-2 NGC, DENV-3 H87 and DENV-4 Dak. DENV-4 was het meest infectieuze serotype, gevolgd door DENV-2, DENV-1 en DENV-3. Het hoogste percentage geïnfecteerde cellen werd bekomen in HMEC-1 cellen, terwijl de infectie van primaire HMVEC-d en HUVEC cellen resulteerde in vergelijkbare, maar lagere infectiegraden. We toonden aan dat de waargenomen verschillen in infectiegraad  correleren  met de expressie van HS op het oppervlak van deze cellen. Met behulp van een ‘custom-made’ Bio-Plex assay kwantificeerden we de hoeveelheid van 18 cytokines die betrokken zijn in de regulatie van EC permeabiliteit of de rekrutering en/of activatie van immuuncellen. Infectie van EC door DENV 1-4 resulteerde in een sterke opregulatie van IL-6, MCP-1, RANTES, CXCL9, CXCL10 en CXCL11. Bovendien werd een tijdsafhankelijk cytopathogeen effect waargenomen in alle EC types na infectie door DENV 1-4. Specifieke apoptosis testen detecteerden de translocatie van fosfatidylserine naar de extracellulaire zijde van het plasmamembraan in DENV 1-4-geïnfecteerde HMEC-1 cellen en de activatie van caspase-3 in DENV-4-geïnfecteerde HMEC-1 en HUVEC cellen. Om het effect van directe infectie van EC op vasculaire permeabiliteit na te gaan, werd de integriteit van een HUVEC monolaag tijdens infectie door DENV-4 opgevolgd in real-time. We merkten op dat DENV-4 infectie van EC de celindex van de monolaag niet veranderde in vergelijking met de niet-geïnfecteerde cellen. Echter, wanneer de DENV-4-geïnfecteerde cellen werden gestimuleerd met TNF-α 24 uur na  infectie, werd een sterke daling in de cell index waargenomen, in vergelijking met de niet-geïnfecteerde EC die behandeld werden met TNF-α. Deze resultaten suggereren dat DENV infectie EC gevoelig maakt voor het permeabiliteitsinducerende effect van TNF-α, hoewel het onderliggende mechanisme nog dient opgehelderd te worden." "Studie van de cellulaire receptoren betrokken in de intrede van Respiratoir Syncytieel Virus (RSV)" "Kurt Vermeire" "Laboratorium Virologie en Chemotherapie (Rega Instituut)" "Onze onderzoekseenheid richt zich op de studie van nieuwe entry-inhibitoren voor het humaan Respiratoir Syncytieel Virus (RSV). In het huidige onderzoeksproject gaan we ons richten op (i) de karakterisering van specifieke cellulaire receptoren voor RSV entry in longcellen, en (ii) de maturatie en processing van de virale enveloppe-eiwitten tijdens het entry-proces. " "Karakterisatie van een nieuw immuno-evasie mechanisme van het Respiratoir Syncytieel Virus (RSV) en evaluatie van het belang ervan voor de ontwikkeling van nieuwe vaccins en profylactische en/of therapeutische antistoffen." "Peter Delputte" "Laboratorium voor Microbiologie, Parasitologie en Hygiëne (LMPH)" "Het respiratoir syncytieel virus (RSV) is bij jonge kinderen de belangrijkste en bij volwassen de tweede belangrijkste oorzaak, na influenza, van ernstige lage luchtweg infecties. Er zijn momenteel geen vaccins, noch antivirale middelen beschikbaar om ernstige RSV infecties te controleren. Er werd aangetoond dat het RSV F eiwit een belangrijk doelwit is voor therapie en prophylaxie. F eiwit-specifieke antistoffen, zoals Palivizumab, zijn beschikbaar. Deze zijn echter niet 100% effectief aangezien RSV-gerelateerde hospitalisaties maar tot 55% gereduceerd worden. Bovendien vermoedt men dat vaccins in ontwikkeling mogelijks onvoldoende zullen beschermen, aangezien zelfs na natuurlijke infectie en inductie van F-neutraliserende antistoffen frequent herinfecties voorkomen. Aangezien herinfecties voorkomen zonder antigene wijzigingen zoals drift of shift (influenza), moet RSV over een ander mechanisme(n) beschikken om te ontsnappen aan specifieke immuniteit.De huidige kennis van de functionaliteit van het RSV F eiwit is echter onvoldoende om inzicht te hebben in de mechanismen die betrokken zijn bij deze immuno-evasie. Er is dan ook een ernstig risico dat zowel monoklonale antistoffen als vaccins die momenteel in ontwikkeling zijn onvoldoende werkzaam zullen zijn.Recent hebben wij met onze onderzoeksgroep aangetoond dat na binding van RSV-specifieke antistoffen met het F eiwit dat tot expressie komt op het oppervlak van geïnfecteerde cellen, internalisatie plaatsvindt van RSV F eiwit-antistof complexen. Als gevolg hiervan zullen geïnfecteerde cellen vermoedelijk onvoldoende kunnen worden herkend en worden uitgeschakeld door de anstistof-afhankelijke immuniteit. Bovendien zal dit waarschijnlijk ook interfereren met immunogeniciteit van het F eiwit en inductie van een sterke immuunrespons. Deze bevinding kan resulteren in volledig nieuwe inzichten (1) in RSV pathogenese en het frequent voorkomen van herinfecties en (2) voor de ontwikkeling van nieuwe RSV vaccins en antistoffen. De doelstelling van dit project is dan ook om dit proces in detail te ontrafelen, zowel in vitro als in vivo. Meer specifiek zullen we (A) het internalisatieproces en de gevolgen ervan voor immuno-evasie karakteriseren, (B) de F eiwit aminozuren betrokken bij het proces identificeren en mutante F eiwitten ontwikkelen die niet kunnen internaliseren, (C) recombinante virussen maken met deze mutante F eiwitten en (D) deze recombinante virussen in een in vivo muismodel evalueren." "Identificatie van de intredepoort van het White spot syndrome virus bij enkele garnalenspecies en ontwikkeling van een lokale barrière ter bescherming" "Hans Nauwynck" "Vakgroep Translationele Fysiologie, Infectiologie en Volksgezondheid" "Porcien reproductief en respiratoir syndroom (PRRS) is een verwoestende ziekte bij varkens, gekenmerkt door reproductieve en ademhalingsproblemen. Het wordt veroorzaakt door een arterivirus met een specifiek tropisme voor macrofagen. Onlangs, meer virulente stammen ontstaan ​​in Europa en Azië veroorzaken hoge sterfte. Vaccins verliezen hun effectiviteit en om een ​​antwoord te vinden voor dit probleem, een beter inzicht in de virale infectie en immuunrespons zijn essentieel. laboratorium van de promotor heeft al een groot deel van het virus entry (receptoren / virale liganden, het belang van siaalzuren op virale liganden, de rol van de lage pH / proteasen) en, op basis van deze informatie geïdentificeerd, ontwikkelde een nieuwe geïnactiveerd vaccin. Echter, er zijn nog verschillende stukjes van de puzzel ontbreekt. Eerst wordt de internalisatie mechanisme niet volledig begrepen. Sialoadhesine is de belangrijkste internalisering molecuul, maar niet een bekende endocytische motief in de cytoplasmatische staart bevatten. Cellulaire co-factoren zijn waarschijnlijk betrokken en zullen worden geïdentificeerd. Verder zal worden nagegaan of sialoadhesine gerecycled naar het celoppervlak na endocytose. Ten tweede, verder naar beneden in het proces voor het invoeren, bleek dat proteases zijn betrokken bij virus demontage. In dit project deze protease de virale ligand dat wordt gekliefd worden geïdentificeerd. In een laatste deel van het project zal worden onderzocht waarom nieuwe zeer virulente stammen in staat zijn om monocytische cellen die niet sialoadhesine niet dragen infecteren; een nieuwe receptor zal worden getraceerd." "Anti-HIV activiteit en werkingsmechanisme van griffithsine, feglymycine en labyrinthopeptines, drie in de natuur voorkomende peptiden" "Dominique Schols" "Laboratorium Virologie en Chemotherapie (Rega Instituut), Moleculaire Immunologie (Rega Instituut)" "In 2011 waren er wereldwijd ongeveer 34 miljoen mensen, zowel volwassenen als kinderen, geïnfecteerd met het humaan immunodeficiëntie virus (HIV), de veroorzaker van AIDS. De ergst getroffen regio's zijn de Afrikaanse landen gelegen ten zuiden van de Sahara. Voornamelijk door de socio-economische en culturele aspecten (zoals religie, polygamie, verkrachtingen en oorlog) worden vooral vrouwen besmet met HIV. Deze infectie gebeurt meestal in combinatie met andere aandoeningen zoals bacteriële vaginosis of sexuele overdraagbare ziekten waaronder syfilis en genitale herpessimplex virus type 2 (HSV-2) infecties. Hoewel het aantal nieuwe HIV-infecties de laatste jaren gedaald is in Afrika, werd er in andere delen van de wereld (vb. Oost-Europa, Midden Oosten en Centraal-Azië) een toename gerapporteerd door UNAIDS. Door de enorme diversiteit van de HIV subtypes wereldwijd (vb. subtype B in Europa en Amerika, subtype C in Afrika) is er nog geen werkzaam vaccin beschikbaar, maar is dankzij het grote aanbod in antiretrovirale geneesmiddelen, toegediend in een combinatietherapie, HIV meer en meer een chronische aandoening geworden in plaats van een dodelijke ziekte. Tot op heden kan geen product HIV genezen, maar slechts de virale replicatie onderdrukken. Daarom is het noodzakelijk ommet goede preventiecampagnes en -methoden, mensen bewust te maken over de risico's en de mogelijke gevolgen van HIV/AIDS-infecties. Dit in combinatie met een goede behandeling is een eerste grote stap in het terugdringen van het aantal HIV-geïnfecteerde personen. In de laatste 15 jaar is er koortsachtig gezocht naar een werkzaam microbicide om de sexuele transmissie van HIV te stoppen. Microbiciden zijn toepassingen (vb. vaginale/rectale gel, crème, films of intravaginale ringsystemen) die vrouwen en ook mannen kunnen gebruiken, en indien nodig zonder medeweten van de partner of andere personen. Na falende klinische studies met breed-spectrum microbiciden met een aspecifiek werkingsmechanisme (vb. spermiciden,detergenten) is er overgeschakeld naar specifieke antivirale middelen die ingrijpen op cruciale stappen in de virale replicatiecyclus. Dit heeft geleid tot een belangrijke doorbraak, waarbij een 1% vaginale tenofovir gel, toegediend binnen de 24 uur zowel voor als na de geslachtsgemeenschap, de HIV-1 en HSV-2 transmissie reduceerde in vrouwen met, respectievelijk, 39% en 51%. HIV partikels hebben aan hun oppervlakte sterk versuikerde structuren die een mogelijk nieuw doelwit zijn voor een nieuwe klasse van antivirale middelen, de carbohydraat-bindende agentia (CBAs), die aanzien worden als mogelijke kandidaat microbiciden. Zoals voor de behandeling van HIV/AIDS-infecties, zal een effectief microbicide waarschijnlijk ook een combinatie van minstens twee verschillende producten zijn. Oraal toegediend tenofovir, tevens het meest voorgeschreven anti-HIV geneesmiddel voor de behandeling van HIV/AIDS-infecties, is recent ook goedgekeurd in combinatie met emtricitabine (gekend als Truvada(R)) voor de preventie van HIV-infecties.In ons onderzoek hebben we kunnen aantonen dat tenofovir perfect combineerbaar is met CBAs (vb. HHA, GNA, MVN,BanLec,...) van diverse oorsprong en dat dit een versterking geeft in hun antivirale activiteit, alsook een reductie in hun mogelijke toxiciteit (Hoofdstuk 3).Hoewel de glycanen aan de oppervlakte van HIV een interessant doelwit zijn voor antivirale therapie, zijn er toch ook enormeverschillen tussen de HIV subtypes onderling. Hier hebben we specifiek onderzoek gedaan naar de subtypes B en C, mits zijn verantwoordelijk zijn voor >60% van de totale HIV-1-infecties wereldwijd. Daarom hebbenwe nagegaan of griffithsine (GRFT), het meest krachtige CBA beschreven tot nu toe, gecombineerd kan worden met verschillende klassen van antiretrovirale middelen (vb. integrase-, entry- en reverse transcriptase inhibitoren) en of er compleet verlies optreedt in activiteit wanneer bepaalde glycaanstructuren afwezig zijn. Het was gerapporteerd dat twee specifieke suikers op gp120 (nl. N234 en N295) cruciaal bleken te zijn voor deantivirale activiteit van GRFT. Door verschillende subtypes te nemen die deze of één van beide wel en/of niet hebben, konden we aantonen dat GRFT activiteit verliest in afwezigheid van deze suikers, maar toch nog steeds een sterke antivirale activiteit vertoonde en dit zelfs in de nM-range. Bovendien kan GRFT gecombineerd worden met HIV-1 inhibitoren zoals maraviroc (CCR5 receptor inhibitor), enfuvirtide (gp41 fusie inhibitor), raltegravir (integrase inhibitor) en tenofovir (reverse transcriptase inhibitor) (Hoofdstuk 4). Elk CBA herkent specifieke suiker-groepen (vb. mannose, N-aceylglucosamine) en hun verbindingen (vb. alpha(1,6) of alpha(1,2)). Gebaseerd op bovenstaande resultaten zijn we gaanonderzoeken of CBAs onderling gecombineerd kunnen worden tegen zowel HIV-1, HIV-2 en enkele in vitro gegenereerde HIV-1 CBA-resistente stammen (Hoofdstuk 5). Opnieuw hebben we het onderzoek voornamelijk toegespitst op GRFT. Hier hebben we tevens voor het eerst bewezen dat GRFT en het banaan-lectine (BanLec) ook een zeer potente anti-HIV-2-activiteit vertonen. Heel wat (pre)klinische antiretrovirale middelen hebben geen of verliezen enorme activiteit tegen HIV-2 (vb. enfuvirtide, 2G12 mAben microvirine (MVN)). Verder is uit deze resultaten gebleken dat GRFT in combinatie met verschillende soorten CBAs (oa. MVN, BanLec, het unieksuiker-herkennend antilichaam 2G12) de HIV-replicatie beter kon afremmen. Opvallend was dat indien we de CBAs HHA en GNA combineerden, dit antagonistische en/of additieve effecten tegen wild-type HIV stammen gaf en synergie tegen CBA-resistente HIV-1 stammen. Bij deze resistente stammenwaren 1 (bij HIV-1 NL4.32G12mAbres. virus) tot 4 bindingsplaatsen voor glycanen (bij HIV-1 NL4.3MVNres. virus) verwijderd door mutatie. GRFT enBanLec behielden overigens hun krachtige antivirale activiteit tegen deze 2 CBA-resistente virussen. Deze resultaten tonen aan dat de geteste CBAs een verschillend en uniek bindingspatroon vertonen op het gp120 en dat affiniteit en kinetiek cruciale factoren zijn in hun antivirale activiteit.In sperma en cervicovaginale secreten van HIV-geïnfecteerde personen komen zowel cel-vrije virale partikels voor als HIV-geïnfecteerdeimmuuncellen (oa. T-lymfocyten, macrofagen). Deze cellen kunnen gemakkelijk via T cel - T cel contacten HIV doorgeven aan niet-geïnfecteerde cellen. Dendritische cellen (DCs) zijn één van de eerste typen van cellen waarmee HIV in contact komt. Deze cellen brengen DC-SIGN tot expressie, een aanhechtingsreceptor voor HIV, en na binding met deze receptor wordt het virus efficiënt overgedragen naar niet-geïnfecteerde CD4+ T cellen in de lymfeknopen. In hoofdstuk 6 zijn we nagegaan of GRFT in staatis, alleen en in combinatie met alle huidige klassen van antiretrovirale middelen (entry-, reverse transcriptase-, integrase- en protease-inhibitoren), de HIV transmissie/replicatie en CD4+ T cel destructie te inhiberen via deze T cel - T cel en DCs - T cel contacten. Deze intercellulaire contacten resulteren in de vorming van meerkernige reuzecellen (syncytia). Hier hebben we kunnen visualizeren hoe deze reuzecellen gevormd worden in functie van de tijd via de JuLI(TM) analysator en hoe de doelwitCD4+ T cel populatie vernietigd wordt. Uit deze resultaten is gebleken dat GRFT, alleen en in combinatie, deze beide manieren van HIV cel-cel-transmissies kan blokkeren en zo de destructie van de CD4+ T cel populatie kan tegengaan.In een tweede luik van deze thesis hebben we onsverdiept in het antivirale spectrum en het werkingsmechanisme van de nieuwe antibiotica feglymycine (FGM) en labyrinthopeptine A1 (LabyA1). FGM, een peptide van 13 aminozuren, vertoont een consistente breed-spectrumanti-HIV-activiteit tegen zowel infectie met cel-vrij virus als cel-celtransmissie. In de DC-SIGN afhankelijke transmissieroute inhibeert FGM niet de binding van het virus aan DC-SIGN, maar wel de daaropvolgende replicatie na cocultivatie met CD4+ doelwit-T cellen. Dit toont aan dat deglycanen op gp120 niet betrokken zijn in het antivirale werkingsmechanisme van FGM. Uit diverse virusbindingsstudies en virale replicatietestenkonden we bewijzen dat FGM de binding van gp120 aan CD4 inhibeert (Hoofdstuk 7). Een alanine-scan van FGM, waarbij ieder aminozuur systematischvervangen werd door het neutrale aminozuur alanine, resulteerde in een significant verlies van antivirale activiteit en affiniteit voor het virale envelope proteïne gp120 wanneer het zure L-aspartaat op positie 13 vervangen werd door een neutraal alanine. Wanneer HIV werd opgekweekt in aanwezigheid van toenemende concentraties FGM, werden door selectie tweeunieke mutaties in gp120 gedetecteerd, nl. I153L in de V2 lus en K457I in de C5 regio. Deze twee mutaties liggen in de buurt van regio's betrokken bij de interactie met de cellulaire CD4 receptor. Het HIV-1 IIIBFGMres. virus vertoonde eveneens kruisresistentie met de twee gekende producten namelijk dextraan-sulfaat en cyclotriazadisulfonamide (CADA), die, respectievelijk, op een directe en indirecte manier, interfereren met de gp120/CD4 interactie. Eveneens hebben we antivirale activteit van de labyrinthopeptines bestudeerd (Hoofdstuk 8). Deze behoren tot een heel nieuwe klasse van de lantibiotica (lanthionine-bevattende antibiotica). Het meest gekende en tot nu toe enige gebruikte lantibioticum is nisine. Op heden zijn LabyA1 en LabyA2 de twee enige ontdekte labyrinthopeptines en preliminaire data toonden een matige anti-herpes-activiteit aan in vitro. Uitgaande van die resultaten, zijn we deze peptiden gaan evalueren voor hun anti-HIV-activiteit, mits er meer en meer bewijs is dat HIV-1 en HSV-2 negatief synergistisch zijn. In diverse cellijnen en tegen verschillende wild-type en drug-resistente HIV- en HSV-stammen bleek LabyA1 een consistente antivirale activiteit te bezitten. LabyA2 was niet actief tegen HIV en zwakker dan LabyA1 tegen HSV. Nisine, meegenomen als referentie product, vertoonde geen enkele antivirale activiteit. Zoals beschreven voor GRFT en FGM, inhibeert LabyA1 ook de DC-SIGNgerelateerde HIV-transmissie en de fusie tussen persistent HIV-geïnfecteerde T cellen en CD4+ niet-geïnfecteerde T cellen. Virusbindingsexperimenten en replicatiestudies toonden aan dat LabyA1 interfereert met het binnendringen van HIV-1 en HSV-2. Uit diverse HIV experimenten is gebleken dat LabyA1 bindt aan het oppervlakte-glycoproteïne gp120 en hierdoor virusbinding voorkomt in een post-CD4 bindende stap. Mits HIV-1 en HSV-2 twee co-pathogenen zijn die elkaars infectie kunnen versterken, kan LabyA1 een goede microbicide kandidaat zijn bij toediening bijvoorbeeld in een vaginale gel. Daarom is het noodzakelijk om de veiligheid van LabyA1 na te gaan, vermits in het verleden is gebleken dat er bij klinische studies toxiciteit optrad bij potentiële microbiciden (vb. nonoxynol-9) en zelfs een verhoging van de virale transmissie. Een microbicide mag de epitheliale celintegriteit niet schaden, geen inflammatie veroorzaken en de immuuncellen niet activeren. Wanneer PBMCs worden behandeld met LabyA1, in contrast met het mitogeen lectine phytohemagglutinine (PHA), werd geen toename gezien in de expressie van de cellulaire activatiemerkers (zoals CD69 en CD25), noch een verhoogde HIV-replicatie en ook geen significante inductie van diverse (inflammatoire) cytokinen en chemokinen. Eennatuurlijk afweermechanisme tegen pathogene indringers is de vaginale flora, waarbij vaginale Lactobacillen een zuur milieu creëren.Dus mag een potentieël microbicide de vaginale flora niet verstoren. Mits LabyA1 een antibioticum is, hebben we de impact op de groei van verschillende vaginale Lactobacillen vergeleken met nisine. LabyA1heeft hier geen effect, terwijl nisine de meeste van de geteste Lactobacillen doodt aan relatief lage concentraties. Zo konden we eveneens de verscheidenheid aantonen tussen de krachtige antivirale en antibacteriële activiteit van bepaalde lantibiotica. Door zijn tweevoudige antivirale activiteit, die bovendien consistent is tegen beide virussen (in tegenstelling tot tenofovir, waarbij de anti-HSV-2-activiteit veel minder is dan voor HIV), heeft LabyA1 een mogelijkheid voor ontwikkeling als microbicide. Mits een microbicide wellicht zal bestaan uit minstens twee actieve producten, hebben we gekeken of er synergie optreedt met andere klinisch gebruikte anti-HIV (vb. tenofovir, raltegravir, saquinavir) en anti-HSV (vb. acyclovir) geneesmiddelen. Uit de combinatiestudies is gebleken dat LabyA1, eveneens gecombineerd kan worden met verschillende klassen van antivirale middelen. In de zoektocht naar eeneffectief microbicide tonen de data in dit doctoraatsonderzoek aan dat de groep van de CBAs perfect gecombineerd kan worden met klinische gebruikte en talrijke preklinische antivirale middelen. De labyrinthopeptineskunnen gezien worden als basispeptiden voor de ontwikkeling van nieuwe en krachtigere moleculen met een activiteit tegen zowel HIV en HSV; terwijl nieuwe derivaten van FGM misschien kunnen leiden tot krachtigere CD4/gp120 inhibitoren.        " "Geneesmiddel-gemedieerde modulatie van hepatische galzouttransportproteïnen" "Pieter Annaert" "Farmacotechnologie en Biofarmacie" "Transportproteïnen (transporters, carriers) spelen een belangrijke rol in de dispositie van zowel endogene als exogene moleculen en hebben daarbij een impact op de veiligheid en werkzaamheid van vele geneesmiddelen. Dit wordt duidelijk wanneer geneesmiddelen interfereren met de functie van transportproteïnen, hetgeen kan leiden tot interacties tussen geneesmiddelen onderling of tussen geneesmiddelen en endogene verbindingen (bv. galzouten). Het nagaan of een potentieel nieuw medicijn een bepaald transportproteïne remt, wordt verwacht op basis van richtlijnen van verschillende regelgevende instanties vooraleer een molecule op de markt gebracht mag worden. Naast het direct effect op de farmacokinetiek en de toxicologische relevantie werd reeds aangetoond dat transportproteïnen farmacologische doelwitten zijn.In de lever is NTCP (Na/Sodium Taurocholate Co-transporting Polypeptide) het belangrijkste transportproteïne verantwoordelijk voor de opname van galzouten uit het bloed. De ontdekking dat NTCP als receptor van het hepatitis B virus (HBV) dient, heeft het zoeken naar remmers van de opname (“entry blockers”) van het HBV in levercellen bevorderd. Het werd duidelijk dat liganden van NTCP ook virusopname konden voorkomen. Gezien de bestaande therapieën niet in staat zijn om het virus volledig uit te roeien, zouden entry blockers de huidige therapeutische opties kunnen aanvullen. Aan de canaliculaire zijde van de levercel transporteert BSEP (Bile Salt Export Pump) bijna exclusief de galzouten naar de gal. Het werd al aangetoond dat inhibitie van BSEP kan leiden tot geneesmiddel-geïnduceerde cholestase (drug-induced cholestasis, DIC), hetgeen in ieder geval te vermijden is bij de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. Bijgevolg vormt de overlap in substraat-specificiteit tussen NTCP en BSEP een belangrijke uitdaging tijdens de ontwikkeling van NTCP-inhibitoren als nieuwe antivirale geneesmiddelen.BSEP-inhibitie is een welgekend mechanisme dat aan de basis ligt van DIC. Desalniettemin is galzouthomeostase een complex proces waarbij niet alleen transportproteïnen, maar ook enzymen en nucleaire receptoren betrokken zijn. Daarnaast kan een potentiële BSEP-inhibitor zijn activiteit alleen uitoefenen als de bereikte ongebonden concentraties aan de bindingsplaats van BSEP voldoende hoog zijn. Humane hepatocyten in sandwich configuratie (sandwich-cultured human hepatocytes, SCHH) worden aanzien als de gouden standard om DIC te detecteren in vitro. Ze bewaren transportproteïne- en enzymexpressie en vereisen dat testverbindingen het intracellulaire compartiment bereiken. Bosentan, een gekend cholestatisch middel in mensen, veroorzaakte geen cholestase in preklinische dierenproeven. Het is nog steeds op de markt, maar kreeg een “FDA black box warning” en vereist het monitoren van de leverfunctie tijdens de behandeling. Ondanks dat in vitro BSEP-inhibitie voorheen werd aangetoond, veroorzaakte bosentan geen cholestase in onze SCHH-gebaseerde DIC-test. Andere mechanismen dan BSEP-inhibitie moeten dus betrokken zijn bij bosentan-geïnduceerde veranderingen in galzouthomeostase, alsook DIC in patiënten. Het algemene doel van dit doctoraatsonderzoek was om nieuwe farmacologische en toxicologische inzichten te verwerven met betrekking tot de hepatische galzouttransportproteïnen NTCP en BSEP, respectievelijk. De specifieke objectieven waren: (1) het identificeren van nieuwe NTCP-inhibitoren die gebruikt zouden kunnen worden voor de behandeling van chronische HBV infectie. (2) Het ontwikkelen van een gevoelige BSEP-inhibitietest, gebruik makend van glycocholzuur (GCA) als substraat, met de bedoeling om BSEP-inhibitie te detecteren bij NTCP-inhibitoren. (3) Het kwantificeren van het effect van therapeutisch relevante bosentan concentraties op galzoutdispositie in SCHH.In het eerste deel van dit werk (Hoofdstuk 3), evalueerden we meer dan 2500 verbindingen voor hun inhiberend potentieel ten opzichte van NTCP in vitro. We gebruikten een gemakkelijke en reproduceerbate test gebaseerd op NTCP-getransfecteerde Chinese-hamster-eierstokcellen en tauro-nor-THCA-24-DBD als fluorescerend substraat. Dertig verbindingen vertoonden concentratieafhankelijke inhibitie van NTCP. De inhibitiedata werd gebruikt om een overlappend (overlay) en virtueel screeningsmodel te maken. Het overlappend model bestaat uit een hydrofobe kern, omgeven door hydrofiele groepen en bijkomende hydrofobe groepen die interageren met NTCP. Dit is in overeenstemming met voorheen gepubliceerde modellen voor NTCP-substraten en inhibitoren. Belangrijk is dat een aniongroep ontbrak in ons overlappend model dat wel aanwezig is in het substraatmodel. Dit is een aanwijzing dat afwezigheid van deze groep een gewenste eigenschap van NTCP-inhibitoren kan zijn. Vervolgens hebben we onze modellen toegepast op de ChEMBL database. Bijkomende NTCP-inhibitoren werden geïdentificeerd in silico waarvan de activiteit werd bevestigd in vitro. Onze modellen werden daarmee gevalideerd en kunnen bruikbaar zijn in de industrie.Om het BSEP inhiberend potentieel van onze NTCP-inhibitoren te bepalen, hebben we een gevoelige en reproduceerbare in vitro test ontwikkeld (Hoofdstuk 4). We gebruikten binnenstebuitengekeerde membraanvesikels, bekomen van BSEP-getransfecteerde HEK293 cellen en niet-radioactief GCA als substraat. Deze unieke combinatie laat toe om GCA te kwantificeren aan zeer lage concentraties met vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandemmassaspectrometrie en zonder de nadelen van het gebruik van een radioactief substraat. Terwijl sommige NTCP-inhibitoren potente BSEP-inhibitoren bleken te zijn, hadden anderen geen effect op BSEP. Dit is een aanwijzing dat het mogelijk is om een onderscheid te kunnen maken tussen NTCP- en BSEP-inhibitie. We hebben de test ook gebruikt om bosentan en zijn metabolieten te beoordelen. We ontdekten dat desmethylbosentan een sterkere BSEP-inhibitor was dan bosentan, daarbij waarschijnlijk bijdragend aan het cholestatisch effect van bosentan. De IC50 waarden waren 56.5 microM en 162.0 microM, respectievelijk. Hydroxybosentan en hydroxydesmethylbosentan inhibeerden BSEP met IC50 waarden van 461.5 microM en 512.4 microM, respectievelijk. Hun bijdrage tot bosentan-geïnduceerde cholestase wordt verwacht beperkt te zijn.Ondanks dat BSEP-inhibitie een cruciale factor is in DIC, zijn er ook andere factoren betrokken bij de ontwikkeling van DIC voor een bepaalde verbinding. Dit wordt geïllustreerd door bosentan. Eerder uitgevoerd onderzoek door onze groep toonde aan dat bosentan niet cholestatisch was in vitro bij supratherapeutische concentraties tot 200 microM. In Hoofdstuk 5 hebben we het effect van bosentan aan therapeutisch relevante concentraties op de omgang met galzouten onderzocht in SCHH. Bosentan verminderde zowel de endogene intracellulaire als extracellulaire glycochenodeoxycholzuur (GCDCA) als GCA hoeveelheden in SCHH. Onze hypothese was daarom dat bosentan zowel de novo synthese van galzouten als conjugatie van ongeconjugeerde galzouten inhibeert. In een tweede fase van dit werk werden SCHH blootgesteld aan exogeen chenodeoxycholzuur (CDCA) in aan- en afwezigheid van bosentan. We observeerden een gereduceerde intracellulaire en canaliculaire GCDCA accumulatie met een verschuiving naar sinusoïdale efflux van GCDCA terwijl de hoeveelheden van CDCA onveranderd bleven. We ontwikkelden een mechanistisch model dat het effect van bosentan op CDCA en GCDCA kwantificeert. Het model bevestigde het inhiberend effect van bosentan op canaliculaire GCDCA klaring. Dit onderzoek bezorgde ons inzicht in de galzoutveranderingen geïnduceerd door bosentan aan klinisch relevante concentraties. De verminderde vorming van GCDCA en verschuiving naar sinusoïdale efflux van GCDCA zou deze observaties kunnen verklaren.Dit doctoraatsonderzoek verschafte kennis met betrekking tot het effect van small molecules op de hepatische transportproteïnen NTCP en BSEP. Aan de hand van in vitro en in silico methoden werden nieuwe NTCP-inhibitoren geïdentificeerd, wat zou kunnen leiden tot een nieuwe behandelingsoptie voor chronische HBV-infectie. Het chemometrisch model zou interessant kunnen zijn voor de industrie om bijkomende NTCP-inhibitoren te identificeren en verifiëren. Een gevoelige en reproduceerbare BSEP-inhibitietest werd ontwikkeld. Verschillende NTCP-inhibitoren inhibeerden gelijktijdig BSEP waardoor het risico op het ontwikkelen van DIC verhoogt. Gebaseerd op de substraat overlap tussen NTCP en BSEP, stellen we voor om inhibitie van BSEP uit te sluiten onder de NTCP-inhibitoren. We evalueerden bosentan en zijn drie belangrijkste metabolieten in de mens in onze BSEP-inhibitietest. Desmethylbosentan bleek een meer potente inhibitor te zijn dan bosentan. Blootstelling van SCHH aan therapeutisch relevante bosentan concentraties veroorzaakte veranderingen in zowel endogene als exogene galzouten. Uit het mechanistisch model bleek de galklaring van GCDCA het overheersende mechanisme te zijn, verantwoordelijk voor de gereduceerde GCDCA hoeveelheden in de canaliculi. Bovendien observeerden we een gereduceerde intracellulaire GCDCA hoeveelheid wat het resultaat kan zijn van directe inhibitie van CDCA conjugatie met glycine, wat kan bijdragen tot dit effect. Verder onderzoek naar andere mechanismen betrokken bij bosentan-geïnduceerde cholestase is nodig en zou de basis kunnen leggen voor nieuwe biomarkers voor DIC."