Titel Promotor Affiliaties "Korte inhoud" "Voorkomen en karakterisatie van residuele contaminatie en biofilms in de productieomgeving van levensmiddelenbedrijven en drinkwatersystemen van pluimvee" "Hans Steenackers, Jos Vanderleyden" "Afdeling: Centrum voor Microbiële en Plantengenetica, Microbiële en Plantengenetica (CMPG)" "Ondanks reiniging en ontsmetting (R&O) kunnen residuele bacteriële contaminatie en biofilms voorkomen in omgevingen zoals voedingsbedrijven en primaire dierlijke productie. Wanneer er bederf- en pathogene organismen achterblijven kunnen deze leiden tot vroegtijdig voedselbederf en voedsel-gerelateerde ziekten wat een risico kan vormen voor de dierlijke en humane gezondheid. Verdere kennis betreffende het voorkomen, de samenstelling en eigenschappen is nodig om de impact van deze residuele bacteriële contaminatie beter in te schatten. Daarom was het doel van dit onderzoek om inzichten te verwerven in de aanwezigheid en eigenschappen van residuele bacteriële contaminatie en biofilms in verschillende voedingssectoren en in de primaire dierlijke productie, meer specifiek in het drinkwatersysteem (DWS) in vleeskuikenstallen.In het eerste deel van dit onderzoek (hoofdstukken 3 en 4) werden biofilms en residuele bacteriële contaminatie in acht voedingsbedrijven uit verschillende sectoren in kaart gebracht en onderzocht. Daarvoor was er nood aan een geschikte bemonsteringsmethode voor de detectie en/of kwantificatie van micro-organismen en biofilm matrix componenten. Twee oppervlakte bemonsteringsmethoden werden getest, de sponsstick methode en de schraper-flocked swab methode, waarvan de laatste geëvalueerd werd als de meest geschikte. Bacteriële tellingen waren gemiddeld 3.62 ± 1.20 log KVE/100 cm², maar konden oplopen tot 7.23 log KVE/100 cm². Respectievelijk 20%, 15% en 8% van de onderzochte oppervlakken bevatten lage hoeveelheden eiwitten, suikers en uronzuren. Op 17% van de onderzochte oppervlakken werden zowel micro-organismen als minstens één van de chemische componenten teruggevonden, wat een indicatie is voor de aanwezigheid van biofilm. De aanwezigheid en mate van residuele contaminatie is zeer variabel per voedingssector, bedrijf, locatie en zelfs tijdstip. Genera die het meest geïdentificeerd werden op voedings-contactoppervlakken na R&O zijn Pseudomonas, Microbacterium en Stenotrophomonas, hoewel 60% van de geïdentificeerde genera bedrijfsspecifiek waren. Van alle geëvalueerde isolaten hadden 88% enige mate van bederfpotentieel, waarbij de mogelijkheid tot vetafbraak het meest voorkwam. Toch blijft het moeilijk om de mogelijke impact van deze micro-organismen op voedselveiligheid en bederf in te schatten omdat het niet gekend is of deze: zullen overgebracht worden van het oppervlak naar het voedingsmiddel, overleven en groeien in het voedingsmiddel en bijgevolg bederf veroorzaken.In het tweede deel van het onderzoek (hoofdstukken 5 en 6) lag de focus op residuele contaminatie en biofilmvorming aan de binnenzijde van het DWS in vleeskuikenstallen na desinfectie. De aanwezigheid van de contaminatie aan de binnenzijde van het DWS werd geëvalueerd op basis van bacteriële belasting en chemische samenstelling. Gemiddelde bacteriële tellingen van 6.03 ± 1.53 log KVE/20cm² werden geobserveerd met maxima tot 9.00 log KVE/20cm² op sommige plaatsen. Eiwitten, suikers en uronzuren werden opnieuw in lage aantallen teruggevonden in respectievelijk 58%, 14% en 5% van de stalen. Op 63% van de onderzochte oppervlakken werd de aanwezigheid van biofilm vermoed door de simultane aanwezigheid van micro-organismen en chemische componenten. De meest geïdentificeerde dominante species in het DWS waren Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas geniculata en Pseudomonas aeruginosa, welke opportunistische humane pathogenen zijn. Echter op species-niveau waren de meeste geïdentificeerde micro-organismen opnieuw bedrijfsspecifiek. Bijna alle isolaten behorend tot de drie meest abundante species werden geëvalueerd als sterke biofilmvormers. Over het algemeen hadden 92% van de geteste micro-organismen biofilmvormende eigenschappen in 96-well microtiterplaten. Tot slot werd de hypothese dat commensale bacteriën in biofilms de aanhechting van pathogenen, zoals Salmonella spp., zou voorkomen onderzocht. Aangezien er een toenemend probleem met Salmonella Java contaminatie in vleeskuikens heerst in België werd de interactie tussen deze pathogeen en de commensaal Pseudomonas putida (onderdeel van de natuurlijke microbiota in het DWS) onderzocht. Daarvoor werd er eerst een nieuw model ontwikkeld en gevalideerd die biofilmvorming aan de binnenzijde van het DWS simuleert. In dit model werd Salmonella Java geëvalueerd als sterke biofilmvormer. Echter, wanneer aangebracht in aanwezigheid van Pseudomonas putida werd biofilmvorming door Salmonella Java gereduceerd door competitieve interacties, wat het potentieel van Pseudomonas putida als biocontrole agens aangeeft.In conclusie heeft dit onderzoek interessante nieuwe informatie verschaft voor voedingsbedrijven in hun strijd tegen ongewenste contaminatie en voor de ontwikkeling van meer efficiënte R&O procedures. Ook in de primaire dierlijke productie werden de eerste inzichten in de aanwezigheid en samenstelling van DWS contaminatie en de rol van commensale biofilms in de preventie van pathogeen-aanhechting verworven." "De biologische controle van orale biofilms met Bdellovibrio bacteriovorus." "Marc Quirynen" "Parodontologie en Orale Microbiologie, Laboratorium voor Klinische Microbiologie" "Het sleutelprobleem in de behandeling van orale infecties, net zoals voor andere medische infectieziekten en voor industriële toepassingen (drinkwater zuivering, afvalwaterverwerking, oliewinning, papierproductie, koelwater van kernreactoren, scheepvaart, medische implantaten) is de vorming en het effectief verwijderen van biofilms. De weerstand van bacteriën aan antimicrobiële producten in een biofilm is 1000 tot 1500 maal groter dan onder een planktonische vorm(14). Daarnaast vormt het opduiken van antibiotica-resistentie in het veld van de infectieziekten een bijkomend probleem(10,11). Er is daarom nood aan alternatieve therapieën. Gezien al deze problemen is er recent een vernieuwde interesse gekomen in het gebruik van biologische agentia voor biofilm controle. Een groep van organismen die over bovengenoemd potentieel tegen biofilms bezit, zijn bacteriën van het genus Bdellovibrio and like organisms (BALOs). BALOs zijn obligatoire bacteriële parasieten die zich enkel kunnen vermenigvuldigen in het periplasma van bepaalde gram-negatieve bacteriën (prooi). Hun geprefereerde niche zijn gram-negatieve bacteriële biofilms welke zij predateren. Ze beschikken niet over de moleculaire mechanismen om humane cellen binnen te dringen wat verklaart waarom ze tot op heden nog nooit met een infectieuze aandoening geassocieerd werden. Deze eigenschappen maken dat ze over een groot potentieel beschikken om aangewend te worden voor de behandeling van infectieuze processen veroorzaakt door gram-negatieve bacteriën zoals parodontitis. De vernieuwing binnen dit krediet aan navorsers bestaat uit de ontwikkeling van een geheel nieuw concept voor niet-antibiotica gemedieerde behandeling van biofilm geassocieerde bacteriële infecties, zoals parodontitis, via BALOs. Er zijn momenteel geen precedenten voor deze techniek in de orale microbiologie. De basisdoelstellingen van dit krediet zijn dan ook: 1. Bepalen van paropathogeen prooi range en kinetiek met bepaling van de meest krachtige BALOs 2. Ontwikkelen van een qPCR assay voor snelle en accurate kwantificatie van geselecteerde BALOs 3. In vitro bepaling van het effect van BALOs op single-species biofilms bestaande uit paropathogenen 4. In vitro bepaling van het effect van BALOs op multi-species biofilms bestaande uit paropathogenen en niet-pathogene gram-positieve bacteriën 5. Bepaling van het effect van BALOs orale pathogenen in speeksel => Uit deze doelstellingen zal de haalbaarheid en de modaliteiten van een in vivo orale BALO-therapie bepaald worden. De volgende stap zal dan ook zijn, na goedkeuring door de ethische commissie, over te gaan op klinische dierstudies." "De biologische controle van orale biofilms met Bdellovibrio bacteriovorus." "Wim Teughels" "Parodontologie en Orale Microbiologie" "Het sleutelprobleem in de behandeling van orale infecties, net zoals voor andere medische infectieziekten en voor industriële toepassingen (drinkwater zuivering, afvalwaterverwerking, oliewinning, papierproductie, koelwater van kernreactoren, scheepvaart, medische implantaten) is de vorming en het effectief verwijderen van biofilms. De weerstand van bacteriën aan antimicrobiële producten in een biofilm is 1000 tot 1500 maal groter dan onder een planktonische vorm. Daarnaast vormt het opduiken van antibiotica-resistentie in het veld van de infectieziekten een bijkomend probleem. Er is daarom nood aan alternatieve therapieën. Gezien al deze problemen is er recent een vernieuwde interesse gekomen in het gebruik van biologische agentia voor biofilm controle. Een groep van organismen die over bovengenoemd potentieel tegen biofilms bezit, zijn bacteriën van het genus Bdellovibrio and like organisms (BALOs). BALOs zijn obligatoire bacteriële parasieten die zich enkel kunnen vermenigvuldigen in het periplasma van bepaalde gram-negatieve bacteriën (prooi). Hun geprefereerde niche zijn gram-negatieve bacteriële biofilms welke zij predateren. Ze beschikken niet over de moleculaire mechanismen om humane cellen binnen te dringen wat verklaart waarom ze tot op heden nog nooit met een infectieuze aandoening geassocieerd werden. Deze eigenschappen maken dat ze over een groot potentieel beschikken om aangewend te worden voor de behandeling van infectieuze processen veroorzaakt door gram-negatieve bacteriën zoals parodontitis. De vernieuwing binnen dit krediet aan navorsers bestaat uit de ontwikkeling van een geheel nieuw concept voor niet-antibiotica gemedieerde behandeling van biofilm geassocieerde bacteriële infecties, zoals parodontitis, via BALOs. Er zijn momenteel geen precedenten voor deze techniek in de orale microbiologie. De basisdoelstellingen van dit krediet zijn dan ook: 1. Bepalen van paropathogeen prooi range en kinetiek met bepaling van de meest krachtige BALOs 2. Ontwikkelen van een qPCR assay voor snelle en accurate kwantificatie van geselecteerde BALOs 3. In vitro bepaling van het effect van BALOs op single-species biofilms bestaande uit paropathogenen 4. In vitro bepaling van het effect van BALOs op multi-species biofilms bestaande uit paropathogenen en niet-pathogene gram-positieve bacteriën 5. Bepaling van het effect van BALOs orale pathogenen in speeksel => Uit deze doelstellingen zal de haalbaarheid en de modaliteiten van een in vivo orale BALO-therapie bepaald worden. De volgende stap zal dan ook zijn, na goedkeuring door de ethische commissie, over te gaan op klinische dierstudies." "De biologische controle van de orale biofilms met Bdellovibrio bacteriovorus." "Marc Quirynen" "Parodontologie en Orale Microbiologie" "Het sleutelprobleem in de behandeling van orale infecties, net zoals voor andere medische infectieziekten en voor industriële toepassingen (drinkwater zuivering, afvalwaterverwerking, oliewinning, papierproductie, koelwater van kernreactoren, scheepvaart, medische implantaten) is de vorming en het effectief verwijderen van biofilms. De weerstand van bacteriën aan antimicrobiële producten in een biofilm is 1000 tot 1500 maal groter dan onder een planktonische vorm(14). Daarnaast vormt het opduiken van antibiotica-resistentie in het veld van de infectieziekten een bijkomend probleem(10,11). Er is daarom nood aan alternatieve therapieën. Gezien al deze problemen is er recent een vernieuwde interesse gekomen in het gebruik van biologische agentia voor biofilm controle. Een groep van organismen die over bovengenoemd potentieel tegen biofilms bezit, zijn bacteriën van het genus Bdellovibrio and like organisms (BALOs). BALOs zijn obligatoire bacteriële parasieten die zich enkel kunnen vermenigvuldigen in het periplasma van bepaalde gram-negatieve bacteriën (prooi). Hun geprefereerde niche zijn gram-negatieve bacteriële biofilms welke zij predateren. Ze beschikken niet over de moleculaire mechanismen om humane cellen binnen te dringen wat verklaart waarom ze tot op heden nog nooit met een infectieuze aandoening geassocieerd werden. Deze eigenschappen maken dat ze over een groot potentieel beschikken om aangewend te worden voor de behandeling van infectieuze processen veroorzaakt door gram-negatieve bacteriën zoals parodontitis. De vernieuwing binnen dit krediet aan navorsers bestaat uit de ontwikkeling van een geheel nieuw concept voor niet-antibiotica gemedieerde behandeling van biofilm geassocieerde bacteriële infecties, zoals parodontitis, via BALOs. Er zijn momenteel geen precedenten voor deze techniek in de orale microbiologie. De basisdoelstellingen van dit krediet zijn dan ook: 1. Bepalen van paropathogeen prooi range en kinetiek met bepaling van de meest krachtige BALOs 2. Ontwikkelen van een qPCR assay voor snelle en accurate kwantificatie van geselecteerde BALOs 3. In vitro bepaling van het effect van BALOs op single-species biofilms bestaande uit paropathogenen 4. In vitro bepaling van het effect van BALOs op multi-species biofilms bestaande uit paropathogenen en niet-pathogene gram-positieve bacteriën 5. Bepaling van het effect van BALOs orale pathogenen in speeksel => Uit deze doelstellingen zal de haalbaarheid en de modaliteiten van een in vivo orale BALO-therapie bepaald worden. De volgende stap zal dan ook zijn, na goedkeuring door de ethische commissie, over te gaan op klinische dierstudies." "Een geïntegreerde aanpak om Staphylococcus aureus biofilms te bestrijden door middel van designer enzymes" "Rob Lavigne" "Dier en Mens (A2H), Biomedische MRI" "De alarmerende toename van antibioticaresistentie bij de bacteriële ziekteverwekker Staphylococcus aureus (Sa) vormt een kritieke uitdaging in de humane geneeskunde. Bovendien komt Sa veel voor in abcessen en fibrine-geassocieerde biofilms. Deze biofilms beperken de toegankelijkheid van antibacteriële componenten en veroorzaken chronische infecties. De aanvragers ontwikkelden en patenteerden een enzyme-gebaseerde benadering om Sa te bestrijden ((ZL922003), gebaseerd op een 'proof-of-concept' voor abcessen geassocieerd met prothetische gewrichtsinfecties.Dit voorstel zal de voorlopige indiening van het patent versterken door (1) de designer-eiwitten uit te breiden naar een breder gamma aan enzymen en (2) de POC uit te breiden naar andere Sa-biofilm-geassocieerde klinische omgevingen, waaronder subcutane toepassingen (Hidradenitis suppurativa), chronische rhinosinusitis, evenals katheter-geassocieerde biofilms.Vanuit een technisch perspectief zullen we onze kennis en expertise uitbreiden in (a) recombinante eiwitproductie in nieuwe fermentatiestammen (uitbreiding op een 2e patent-ZL922073) (b) de ontwikkeling van een op bioluminescentie gebaseerd, in vivo model in Galleria mellonella larven voor implantaat-geassocieerde biofilms en (c) valideren van ons vermogen om deze eiwitten efficiënt te coaten op titaniumoppervlakken voor lokale afgifte en preventie van biofilmvorming." "Analyse van het werkingsmechanisme van nieuwe antischimmelbiofilm componenten." "Bruno Cammue" "Afdeling: Centrum voor Microbiële en Plantengenetica, Microbiële en Plantengenetica (CMPG)" "Het aantal humane bloedbaaninfecties veroorzaakt door opportunistische schimmelpathogenen is significant gestegen het laatste decennium. Eén van de belangrijkste oorzaken hiervan is het toenemende aantal patiënten met een verzwakt immuunsysteem veroorzaakt door HIV-infectie of chemotherapie. Deze schimmelinfecties zijn geassocieerd met hoge sterftecijfers (20-90%). Candida albicans is de voornaamste humane schimmelpathogeen gevolgd door Aspergillus en Cryptococcus spp. Eén van de belangrijkste virulentiekenmerken van deze pathogenen is hun mogelijkheid om biofilmen te vormen. Biofilmen zijn zeer gestructureerde multicellulaire gemeenschappen van cellen die omgeven zijn door een zelfaangemaakte beschermende film van polysacchariden en zich vasthechten aan biotische en abiotische oppervlakken. Deze biofilmen vertonen in vergelijking met planktonische (vrijlevende) cellen een verhoogde tolerantietegen de huidige antifungale geneesmiddelen en het menselijk immuunsysteem. Verder wordt biofilmvorming beschouwd als zijnde noodzakelijk voor het ontstaan van infecties en is dit gerelateerd aan de overlevingskansen bij deze infecties. Naast het menselijk lichaam kunnen Candida spp. ook biofilmen vormen op abiotische oppervlakken zoals katheders, stemprothesen, implantaten enz., en vormen zo een belangrijke bron van(chronische) infecties. Mede door de vergrijzing van de populatie zal het gebruik van implantaten en andere geïmplanteerde materialen verder toenemen zodat verwacht wordt dat het aantal infecties vanuit biofilmvorming op deze materialen sterk zal toenemen de volgende decennia. Daarom iser een dringende noodzaak om nieuwe moleculen te identificeren die dezebiofilmen kunnen bestrijden. Dergelijke nieuwe moleculen kunnen verder ook gebruikt worden om nieuwe infectiewerende coatings te ontwikkelen voor deze medische materialen. De bovengenoemde klinische noden zijn de hoofddoelen van dit doctoraatsonderzoek.Onderzoeksresultaten van deze doctoraatsthesis bestaan hoofdzakelijk uit drie delen die de identificatie en de studie betreffende het werkingsmechanisme beschrijven van drie nieuw geïdentificeerde componenten met antibiofilmactiviteit, namelijk de chemische component toremifene en twee peptiden, OSIP108 en AS10. Bijkomend wordt de identificatie beschreven van een nieuwe klasse van moleculen met antibiofilmactiviteit (BEC-2, i.e. de laagste concentratie van een component die zorgt voor 50% eradicatie van de biofilm, ≥ 25 µM), de 2,6-digesubstitueerde quinolinen, die echter niet geselecteerd werden voor verder onderzoek.Toremifene behoort tot de familie van oestrogeenreceptor-modulatoren die gebruikt worden bij de behandeling van borst- en prostaatkanker. Daarmee is toremifene een uitstekend voorbeeld van het concept van drug repurposing of het evalueren van geneesmiddelen voor gebruik in andere medische applicaties dan waarvoor ze oorspronkelijk geïdentificeerd waren. In deze studie wordt aangetoond dat toremifene antibiofilmactiviteit vertoont in vitro tegen biofilmvorming van verschillende Candida (BIC-2, i.e. de laagste concentratie van een component die resulteert in 50% inhibitie van biofilmvorming, ≥ 20 µM) en bacteriële spp. en in vivo tegen C. albicans in een subcutaan biofilmkathedermodel in ratten. In dit in vivo model reduceerde toremifene biofilmvorming van C. albicans op subcutaan geïmplanteerde katheders met 56% ten opzichte van de controlebehandeling na orale toediening. Verder kan toremifene ook gebruikt worden als een potentiator voor de activiteit van de huidige antifungale geneesmiddelen, caspofungin  en in mindere mate amphotericin B, tegen C. albicans en C. glabrata biofilmen. Hierbij kon de effectieve dosis van deze antifungale middelen respectievelijk 20- en 5-voudig verlaagd worden in aanwezigheid van toremifene. Ten slotte reduceerde toremifene C. albicans biofilmvorming met 70% in een modelsysteem voor implantaten waarbij het op een gecontroleerde manier wordt vrijgegeven doorheen een titanium oppervlak. Dit systeem werd ontwikkeld in samenwerking met het Departement Materiaalkunde van de KU Leuven.Het tweede en derde deel van dit manuscript beschrijft de identificatie en karakterisatie van twee nieuwe antibiofilmpeptiden, OSIP108 en AS10 die geïdentificeerd werden in respectievelijk plant en muis. Beide peptiden vertonen specifieke antibiofilmactiviteit tegen C. albicans (BIC-2 = 5 en 0.2 µM respectievelijk) waarbij ze de leefbaarheid van de cellen niet aantasten. Dit laatste is een belangrijk voordeel ten opzichte van de klassieke fungicide middelen waarvoor het optreden van resistentie al beschreven is. Bovendien, kunnen deze peptiden de effectieve dosissen van caspofungin en amphotericin B tegen mature C. albicans biofilmen 8- tot 5-voudig verlagen. In tegenstelling tot OSIP108 vertoont AS10 ook antibiofilmactiviteit tegen verschillende bacteriële spp. (BIC-2 ≥ 3 µM) en gemengdebacteriële-fungale biofilmen. Preliminaire resultaten tonen dat de gist-naar-hyfen-transitie en celwandgerelateerde processen belangrijk zijnin het werkingsmechanisme van OSIP108 en dat het werkingsmechanisme vanAS10 verbonden lijkt met de white-to-opaque- omschakeling in C. albicans.Dit doctoraatsonderzoek draagt bij tot de belangrijke zoektocht naar nieuwe antibiofilmcomponenten om de stijgende sterftecijfers van biofilm-geassocieerde infecties tegen te gaan. In dit opzicht is toremifene een waardige component die, gezien zijn mogelijkheid tot orale toediening, een alternatief kan bieden voor de klassieke antifungale middelen in het bestrijden van infecties veroorzaakt door biofilmvorming op diverse medische materialen." "Analyse van tolerantiemechanismen van biofilm-gistcellen aan antifungale componenten en de in vivo relevantie hiervan." "Bruno Cammue" "Afdeling: Centrum voor Microbiële en Plantengenetica" "Candida albicans is onder de pathogene schimmels het vaakst geassocieerd met biofilmvorming en een belangrijke oorzaak van nosocomiale infecties gerelateerd aan het gebruik van implantaten en invasieve apparaten. Deze infecties zijn bijzonder ernstig omdat Candida biofilmcellen resistent zijn tegen een brede waaier van antifungale geneesmiddelenen er slechts weinig effectieve behandelingsmethoden bestaan voor deze biofilm-gerelateerde schimmelinfecties. De basis van deze resistentie istot op heden nog niet volledig opgehelderd, maar kan te wijten zijn aaneen gecombineerde actie van verschillende mechanismen zoals (i) expressie van resistentiegenen, (ii) binding van de antifungale componenten aande extracellulaire biofilmmatrix, (iii) verandering van de samenstelling van gistmembranen of (iv) de aanwezigheid van persisters in de biofilm(overlevende cellen na behandeling met een antimicrobiële stof aan hogeconcentratie). Hierdoor is het noodzakelijk om te zoeken naar nieuwe behandelingsmethoden voor deze biofilm-gerelateerde infecties. Het belangrijkste doel in dit onderzoeksproject was om meer inzicht te krijgen in de tolerantiemechanismen van de humane pathogeen C. albicans tegen antifungale componenten, met een focus op biofilmcellen, en de translatie van deze informatie naar de in vivo situatie. Kennis van de tolerantiemechanismen van gistcellen is van groot belang voor antifungale therapie: de activiteit van een schimmelwerende stof kan mogelijks verhoogd worden door het gebruik van deze stof in combinatie met een inhibitor van zijn tolerantiemechanisme.Het eerste deel van dit werk was gericht op het ontrafelen van de werking en tolerantiemechanismen van planktonische culturen tegen verschillende antifungale componenten. Meer specifiek werden de tolerantiemechanismen van planktonische Saccharomyces cerevisiae cellen tegen miconazole en een piperazine-1 carboxamidine derivaat BAR0329 (4-{[3-(4-chlorobenzyl)-2-methoxyquinolin-6-yl]methyl}piperazine-1-carboximidamide) ontrafeld. Miconazole en BAR0329 induceren de vorming van reactieve zuurstofspecies (reactive oxygen species, ROS) in gevoelige gistsoorten en zijn actief tegen C. albicans planktonische en biofilmcellen. De intracellulaireaccumulatie van beide antifungale componenten in S. cerevisiae isafhankelijk van zogenaamde functionele lipid rafts. Bovendien konden we aantonen dat BAR0329 apoptose induceert geassocieerd met caspasen en mitochondriale splitsing.  Het tweede deel van dit werk was gewijd aan het verkrijgen van meer inzicht in de werking en tolerantiemechanismen van gistcellen in biofilmen tegen conventionele ROS-inducerende antifungale componenten zoals miconazole, amphotericin B en caspofungin. Dit onderzoek stelde vast dat superoxide dismutasen (SODs) een belangrijke rol spelen in de persistentie en tolerantie van C. albicans biofilmen tegen miconazole en amphotericin B.Dit opent de mogelijkheid voor een nieuwe anti-biofilm therapie, bestaande uit de combinatie van een ROS-inducerende antifungale component met specifieke SOD-inhibitoren. Verder onderzoek toonde aan dat de transcriptiefactor Efg1, een centrale regulator van verschillende cellulaire processen in C. albicans, betrokken is bij tolerantiemechanismen van C. albicans biofilmen tegen miconazole, amphotericin B en caspofungin. Phenocopiëring vande deletie van het gen EFG1 door diclofenac-behandeling  bevestigde de rol van Efg1 in tolerantiemechanismen van C. albicans biofilmen tegen caspofungin. De resultaten van dit doctoraatsonderzoek hebben geleid tot een beter fundamenteel inzicht in de tolerantiemechanismen van planktonische en biofilm-gistcellen tegen verschillende klassen van antifungale geneesmiddelen. Het rationele ontwerp van specifieke inhibitoren van cellulaire determinanten (zoals Efg1 en SODs) betrokken bij tolerantiemechanismen van biofilmen tegen conventionele antimycotica kan leiden tot nieuwe anti-biofilm therapieën, dit via de combinatie van een antifungaal geneesmiddel met dergelijke inhibitor. In dit opzicht geven de in vivo resultaten van dit onderzoek duidelijk aan dat modulatie van de activiteit van determinanten betrokken bij tolerantie van biofilmen, zoals via diclofenac, bruikbaar zijn in een combinatie therapie met antifungale geneesmiddelen zoals caspofungin om C. albicans biofilm-gerelateerde infecties te behandelen." "Innovatieve bacteriofaag-geïnspireerde anti biofilm componenten voor Pseudomonas aeruginosa." "Rob Lavigne" "Dier en Mens (A2H)" "De gram-negatieve bacterie Pseudomonas aeruginosa is een gevaarlijke opportunistische humane pathogeen. Eén van de virulentiefactoren verantwoordelijk voor zijn hoge weerbaarheid als pathogeen ligt in de capaciteit van deze bacterie om biofilms te vormen. Dit zijn gestructureerde microbiële gemeenschappen die worden omgeven door een extracellulaire matrix. Ze kunnen gevormd worden op levende organismen of abiotische oppervlakken. Daarenboven verhogen biofilms de resistentie tegen antimicrobiële middelen en verbergen ze de cellen van het afweersysteem van de gastheer. Om die redenen zijn biofilm-geassocieerde infecties meestal chronische infecties, die vaak voorkomen in de longen van mensen die leiden aan mucoviscidose (een genetische aandoening) of in chronische wonden. Deze infecties vertonen een sterk verhoogde morbiditeit en zorgen voor veel extra kosten in de gezondheidssector.  In dit project wordt het potentieel onderzocht van recent geïdentificeerde biofilm inhiberende faageiwitten voor de ontwikkeling van een nieuwe generatie van antibiofilm moleculen. Hiervoor wordt de interactiepartner van deze proteïnen geïdentificeerd, waarna moleculen ontwikkeld worden die de antibiofilm activiteit van deze faagproteïnen nabootsen. Zo wordt een nieuwe generatie middelen ontwikkeld tegen mogelijks evolutionair geselecteerde doelwitten voor de bestrijding van de biofilmvorming in Pseudomonas aeruginosa." "Studie van het antifungaal werkingsmechanisme van het plantdefensine RsAFP2 uit radijs en ontwikkeling van een RsAFP2-gebaseerde sensor voor schimmel- en gistdetectie." "Bruno Cammue" "Afdeling: Centrum voor Microbiële en Plantengenetica, Laboratorium voor Cellulair Metabolisme en Metabole Regeling (VIB-KU Leuven)" "Invasieve schimmelinfecties (ISIs), zoals candidemie en invasieve aspergillose, vormen een grote bedreiging voor patiënten met een verlaagde weerstand of luchtwegaandoeningen. ISIs worden geassocieerd met een hoge morbiditeit en mortaliteit, en worden vooral veroorzaakt door Candida spp. Deze Candida spp. worden steeds meer geassocieerd met infecties op medische apparaten, omdat zij biofilmen kunnen vormen op het oppervlak van bijvoorbeeld katheters, orthopedische implantaten en implanteerbare elektronische apparaten (zoals pacemakers). C. albicans biofilmcellen zijn resistent aan een hele reeks antifungale geneesmiddelen, waardoor de huidige behandelingen gelimiteerd zijn. Enkel miconazole, caspofungin, anidulafungin en liposomale vormen van amfotericine B zijn werkzaam tegen deze biofilmen. Bovendien kan behandeling met deze antifungale geneesmiddelen resulteren in ernstige bijwerkingen, waaronder hepatotoxiciteit en nefrotoxiciteit. Er is dus een nood aan nieuwe antifungale behandelingen.Antimicrobiële peptiden (AMPs) zijn zeer interessant in de zoektocht naar nieuwe therapeutica, doordat zij meerdere werkingsmechanismen hebben waardoor de kans op resistentieontwikkeling door micro-organismen verlaagd wordt. Bovendien worden antifungale AMPs gekarakteriseerd door een fungicide werking en induceren zij snel celdood in een waaier van micro-organismen. Een specifieke groep van AMPs omvat de plantdefensinen. Plantdefensinen zijn algemeen gezien niet toxisch voor humane cellen, aangezien zij specifiek interageren met componenten in het schimmelmembraan. Daarnaast induceren deze peptiden de productie van reactieve zuurstofspecies en apoptose in C. albicans, Saccharomycescerevisiae en/of andere schimmels.Een eerste doel in dit onderzoeksproject was om de werkingsmechanismen van drie plantdefensinen, zijnde HsAFP1, RsAFP2 en AtPDF2.3, te ontrafelen door gebruik te maken van C. albicans en S. cerevisiae als modelsystemen. Zowel inzicht in het werkingsmechanisme van verschillende antifungale componenten, als ontrafeling van mogelijke tolerantiewegen die gebruikt worden door schimmelpathogenen om aan deze antifungale werking te ontkomen, verbeteren onze kennis over hoe deze pathogenen op een efficiënte manier af te doden. In dit werk werd nagegaan of HsAFP1 en RsAFP2 de vorming van C. albicans biofilmen kan tegengaan en/of de afbraak van bestaande biofilmen kan bewerkstelligen. Zowel HsAFP1 als RsAFP2 kunnen C. albicans biofilmvorming tegengaan, maar kunnen echter bestaande biofilmen niet afbreken. Uit HsAFP1-gebaseerde structuur-activiteit-relatie analyses bleek dat de γ-core samen met de flankerende regio’s belangrijk is voor de antibiofilm-activiteit tegen C. albicans. Dit is de eerste keer dat antibiofilm-activiteit van plantdefensinen wordt gerapporteerd. Daarnaast werd onderzocht of AtPDF2.3 een inhibitor is van bepaalde ionenkanalen, aangezien uit in silico analyse bleek dat de aminozuursequentie van AtPDF2.3 een gedeeltelijke toxinesignatuur draagt. Deze toxinesignatuur werd reeds toegekend aan schorpioentoxines die werkzaam zijn op ionenkanalen. Elektrofysiologische metingen gaven aan dat AtPDF2.3 kaliumkanalen kan blokkeren op een gelijkaardige manier als werd beschreven voor schorpioentoxines. In S. cerevisiae lijkt de antifungale activiteit van AtPDF2.3 een tolerantiemechanisme te activeren waarbij kaliumtransport en –homeostase een rol spelen. Zo werd er een link gevonden tussen de antifungale activiteit, met betrokkenheid van kaliumtransport en –homeostase enerzijds, en inhiberende activiteit op kaliumkanalen anderzijds.Het tweede doel van dit onderzoek was het verder ontrafelen van het werkingsmechanisme van amfotericine B, om zo beter te kunnen begrijpen hoe dit antimycoticum celdood induceert. Van amfotericine B is reeds geweten dat het interageert met ergosterol in het schimmelmembraan, wat uiteindelijk leidt tot celdood. Echter, informatie over amfotericine B-geïnduceerde gebeurtenissen die leiden tot celdood, is schaars. Verschillende studies hebben reeds aangetoond dat het analyseren van heterogeniteit in celpopulaties, en meer specifiek de dynamische responsen, naar verschillende stimuli, belangrijk is. Dit gaf ons de aanleiding om ook de amfotericine B-geïnduceerde gebeurtenissen te onderzoeken met spatiotemporele resolutie. Hiertoe werd een nieuw digitaal ‘microfluidics’ (DMF)-platform voor ‘single cell’-analyse van S. cerevisiae ontwikkeld en geïmplementeerd. Dit platform laat toe om individuele S. cerevisiae cellen te analyseren met spatiotemporele resolutie. Zulke resolutie is niet haalbaar met de standaard technieken gebruikt in ‘bulk’ analyses.In eerste instantie werd een ‘proof-of-concept’ uitgewerkt, waarin membraan-permeabilisatie van gistcellen tijdens amfotericine B-behandeling werd onderzocht. Het toestel werd gevalideerd door de resultaten behaald op het DMF-platform te vergelijken met deze behaald via flowcytometrische analyses in ‘bulk’. Gelijkaardige resultaten werden behaald in beide setups, waardoor het DMF-platform geschikt werd bevonden voor ‘single cell’-analyse van gistcellen tijdens antifungale behandeling. Daarna werd de functie van superoxide- en stifstofoxide-radicalen in de fungicide werking van amfotericine B onderzocht. Superoxide-radicalen zijn belangrijk in de fungicide werking van amfotericine B, in tegenstelling tot stikstofoxide-radicalen die een rol lijken te spelen in tolerantiemechanismen aan dit antimycoticum. Een gedetailleerde studie van de kinetiek waarmee superoxide-radicalen en membraan-permeabilisatie voorkomen gaf aan dat inhibitie van de productie van stikstofoxide-radicalen resulteert in zowel verhoogde als versnelde productie van superoxide-radicalen, membraan-permeabilisatie en verlies van reproductiecapaciteit in gist.We concluderen dat de resultaten behaald in dit doctoraal onderzoek bijdragen tot een betere kennis van de werkingsmechanismen van en tolerantiemechanismen aan HsAFP1, RsAFP2, AtPDF2.3 en amfotericine B. Dit is de eerste keer dat antibiofilm activiteit van plantdefensinen wordt gerapporteerd, waardoor de kennis omtrent de biologische activiteiten van plantdefensinen wordt verbreed. Daarnaast beschrijft deze thesis plantdefensinen als mogelijke ‘lead’ voor de ontwikkeling van nieuwe antifungale geneesmiddelen om schimmelinfecties tegen te gaan, op basis van hun antifungale en/of antibiofilm-activiteit. Verder toont deze thesis aan dat het DMF-platform besproken in dit werk kan worden gebruikt om de werkingsmechanismen van componenten te identificeren en mogelijke synergistische interacties tussen componenten te karakteriseren." "Onderzoek naar het werkingsmechanisme van natuurlijke producten geïsoleerd uit Chinese medicinale planten, die actief zijn voor het inhiberen van biofilmgroei bij Candida soorten." "Patrick Van Dijck" "Moleculaire Biotechnologie van Planten en Micro-organismen" "Micro-organismen leven meestal in een biofilm, een gemeenschap van cellen omgeven door een extracellulaire matrix die ze zelf produceren. Dit is ook het geval voor Candida albicans, een humane schimmelpathogeen. Door het veelvuldig gebruik van allerlei implantaten is er een sterke toename van het aantal biofilmen, vooral op katheters. Karakteristiek voor die biofilmen is hun hoge resistentie tegen de gebruikelijke antischimmel producten zodat heel dikwijls de implantaten moeten verwijderd worden na een infectie. De laatste jaren is er dan ook nog een toename gekomen in het aantal infecties met C. glabrata, een schimmel die op zich al veel resistenter is tegen de huidige antischimmel producten. Er is dus dringend nood aan onderzoek naar nieuwe producten. Recent hebben we, in samenwerking met onderzoekers uit China, een aantal natuurlijke producten geïsoleerd uit Chinese medicinale planten. Sommige van deze opgezuiverde componenten zijn zeer actief tegen C. albicans en C. glabrata biofilmen. In dit project zullen we onderzoeken hoe deze componenten werken."