Titel Promotor Affiliaties "Korte inhoud" "'Een geïntegreerde 'omics'aanpak voor het identificeren en karakteriseren van aangeboren glycosylatie defecten" "Gert Matthijs" "Departement Menselijke Erfelijkheid" "Met elke nieuwe ontdekking eindigt de diagnostische odyssee voor de betrokken families, en verruimen we de fundamentele kennis over glycosylatie en andere biologische processen." "Speurtocht naar de nieuwste glycosylatiedefecten (Congenital Disorders of Glycosylation): systematische analyse van onopgehelderde ER en Golgi defecten en onderzoek naar de functie van TPARL." "Gert Matthijs" "Departement Menselijke Erfelijkheid" "Naar therapie van congenitale defecten in glycosylatie" "Peter Witters" "Vrouw en Kind" "Congenitale defecten van de glycosylering (CDG) zijn ernstigemultisystemische aangeboren metabole ziekten. Voor de meeste vandeze weesziekten is er alleen ondersteunende therapie wat dus eenunmet medical need vormt. In PMM2-CDG, het meest voorkomendeCDG, is er, ondanks het uitklaren van de onderliggende genetica enhet enzymatische defect, onvoldoende inzicht in de pathofysiologieom echte therapieën te ontwikkelen.In het huidige onderzoek zullen we dit op een nieuwe, bredeonbevooroordeelde manier bestuderen, door transcriptomics,untargeted metabolomics uit te voeren in een nieuw PMM2-celmodel,namelijk in endotheelcellen (ECs), die ook een sleutelrol spelen in depathofysiologie. We doen dit door farmacologische inhibitie enPMM2-knockdown in ECs van de menselijke navelstrengaders of inbloeduitgroei ECs die rechtstreeks van de CDG patiënten wordengeïsoleerd. Alle relevante endotheelfuncties (bv. barrièrefunctie, ECdysfunctie,rol bij ontstekingen) evenals de veranderde fluxen van demetabole pathways en veranderingen in het cellulaire milieu (zoalsgeïdentificeerd met tracer metabolomics) zullen in detail bestudeerdworden.Geïdentificeerde therapieën zullen worden getest door middel van invitro en ex vivo door nutritionele therapie en beantwoorden zo aandeze unmet medical need. Finaal zullen we dit bekrachtigen inklinische trials.Andere CDG (zoals.SLC35A2-CDG en TMEM165-CDG) zullen metdezelfde aanpak bestudeerd worden." "Studie van congenitale defecten van glycosylatie en hun potentiele behandeling door middel van tracer metabolomics" "Peter Witters" "Vrouw en Kind, Hepatologie, Metabolomics Expertisecentrum (VIB-KU Leuven)" "Congenitale defecten van de glycosylering (CDG) zijn een groep zeldzame ziekten die vaak verschillende organen ernstig aantasten. Biochemisch is er een defect in de glycosylerings mechanisme dat normaal gezien suiker antennes zet op de meeste eiwitten zodat die hun functie correct kunnen uitvoeren. De meeste CDGs zijn niet behandelbaar, maar sommigen CDGs waarbij er te weinig melksuiker (galactose) in de suikerantennes zit zijn behandelbaar met extra galactose supplementen. Het exacte werkingsmechanisme van deze therapie is echter niet gekend en sommige delen van het glycosylerings mechanisme zijn ook nog onbegrepen met de huidige onderzoeksmethodes. Wij stellen een radicale wijziging van onderzoeksmethode voor, met name door het gebruik van ‘tracer metabolomics’. Hierdoor kunnen we de dynamische activiteit van multipele met elkaar verbonden metabole pathways tegelijk bestuderen in patiëntencellen en lever-achtige cellen. De hierdoor verworven kennis (hoe galactose het metabolisme bijstelt) zal nieuwe inzicht geven in het glycosyleringsproces en de behandelingen. Verder zullen we, gebaseerd op deze bevindingen, ook andere types van CDG screenen op het mogelijk positief effect van galactose supplementen." "Europees onderzoeksnetwerk gericht op het verbeteren van de diagnostiek en de behandeling van aangeboren glycosylatie defecten." "Gert Matthijs" "Departement Menselijke Erfelijkheid" "Door de vorming van een Europees netwerk en de uitwisseling van verschillende onderzoeksvisies en standpunten over werkwijzen proberen we op een efiicientere manier te komen tot het verbeteren van de diagnostiek en de behandeling van aangeboren glycosylatie defecten." "Role of ARF6 in PSEN1 mediated endo-lysosomal defects" "Annaert Wim" "Annaert Lab" "Understanding the molecular biology of membrane transport in a disease-related context covering Alzheimer’s disease and congenital disorders of glycosylation type II." "Zebravis als een Model voor Glycosylatiedefecten. Vissen achter de Rol van TMEM165" "Gert Matthijs" "Laboratorium voor Moleculaire Diagnostiek, Departement Menselijke Erfelijkheid" "Aangeboren glycosylatiedefecten (CDG) vertegenwoordigen een heterogene groep van erfelijke ziekten gekenmerkt door foutieve N- en O-glycosylering, en lipidenglycosylering. Defecten in eiwit N-glycosylering, die variëren in ernst en systemische presentatie, worden traditioneel verdeeld in twee groepen. De grootste groep, type I CDG (CDG-I), is het gevolg vandefecten in enzymen die betrokken zijn in de biosynthese van de lipide-gekoppelde oligosaccharide precursor Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolichol (G3M9Gn2-PP-Dol) of in de overdracht naar de pas gevormde eiwitketen in het endoplasmatisch reticulum (ER). De tweede groep, type II CDG (CDG - II), ontstaat uit een verstoring van het knippen en plakken van suikers aan de N-glycaanketen in het ER/intermediair compartiment of in de cis-/trans-Golgi cisternen. Bovendien, en in tegenstelling tot CDG-I, blijken deze defecten niet enkel geassocieerd te zijn met glycosylatie-enzymen maar ook met defecten in ER-Golgi of intra-Golgi transport. Als gevolg van dezeontdekkingen verplaatst de interesse in de aangeboren glycosylatiedefecten zich meer en meer in de richting van intracellulair transport en opbouw en functie van het Golgi compartiment. Een bijzondere CDG, veroorzaakt door mutaties in TMEM165, een transmembraan eiwit waarvan de functie ongekend is, is het onderwerp van dit proefschrift.Via homozygositymapping in combinatie met transcriptoomanalyse op fibroblasten werd ineen Joodse familie met 2 kinderen, een homozygote cryptische splice-mutatie (c.792+182G>A) gevonden in een nieuw gen, nl. TMEM165 (transmembrane protein 165). Deze patiënten vertonen psychomotorische achterstand, dwerggroei en aanzienlijke skeletafwijkingen. Iso-elektrische focussering van serum transferrine toonde een abnormaal patroon dat overeenstemt metCDG-II. De analyse van N-glycanen onthulde een defect in sialylatie en galactosylatie. Bij mutatie-onderzoek bij andere onopgehelderde CDG-II patiënten hebben we nog 3 verschillende missense mutaties ontdekt bij 2 andere patiënten, nl. p.R126H, p.R126C en p.G304R.TMEM165 codeert voor een eiwit met 324 aminozuren met 6 transmembranaire domeinen. TMEM165 is sterk geconserveerd in eukaryoten en behoort tot UPF0016, een familievan integrale membraaneiwitten van onbekende functie. De functie van het genproduct en de pathofysiologie van deze nieuwe CDG zijn onbekend maar recente experimenten wijzen op een rol in calcium/proton transport in de secretorische pathway. TMEM165 zou een belangrijke rol spelen bij hetbehoud van de Golgi structuur en/of pH.Ondanks het groeiende inzicht in de moleculaire functie van TMEM165 blijft de fysiologische relevantie van dit eiwit tijdens de ontwikkeling, met name op het skelet, slechtbegrepen. In een poging om meer kennis te verwerven over de fysiologische en pathogene functies van TMEM165, hanteerden we een morfolino-gebaseerde benadering om de expressie van tmem165 te verminderen in zebravis embryos.Onze resultaten geven aan dat TMEM165 essentieel is voor eengoede kraakbeenontwikkeling. Tmem165-deficiënte embryos vertonen namelijk een verandering in morfologie van verschillende kraakbeenstructuren.Verlies van Tmem165 wordt geassocieerd met een verminderde expressie van het chondroïtinesulfaatproteoglycan aggrecan, evenals verschillende latere markers van zowel kraakbeen- als botmaturatie. Deze defecten resulteerden in verminderde mineralisatie van kraakbeen bij de morfolino-behandelde vissen. Hoewel de defecten in kraakbeen verholpen konden worden door het inbrengen van wild type tmem165 mRNA, kon geen herstel worden waargenomen met tmem165 mRNA dat de missense mutatie R126H bevat. Dit bevestigt het pathogene karakter van deze mutatie. Massaspectrometrische analyse van controle en morphant embryos heeft aangetoond dat tmem165 noodzakelijk is voor een goede verwerking van N-glycanen in de zebravis. Dit resultaat is consistent met het CDG fenotype waargenomen bij de patiënten.Tot slot tonen we met deze studie de impact van tmem165 deficiëntie op de ontwikkeling in de zebravis aan. Bovendien is dit het eerste diermodel voor dit nieuwe type CDG. Onze analyse van tmem165 morphant embryos toont aan dat een deficiëntie in tmem165 in de zebravis leidt tot een verandering in N-glycosylering en tot kraakbeenletsels. Zowel de morfologische als de biochemische kenmerken die in de zebravis werden geobserveerd, weerspiegelen het fenotype bij de patiënten. Dit bevestigt ook ook ondubbelzinnig het causaal verband tussen de TMEM165 deficiëntie en de ziekte." "Onderzoek naar Golgi stress in cellen van patiënten met CDG" "Gert Matthijs" "Departement Menselijke Erfelijkheid" "Congenital Disorders of Glycosylation (CDG) zijn een groep van zeldzame metabole ziekten veroorzaakt door genetische defecten in de glycosylatie. We hebben recent een deficiëntie van MAN1B1 ontdekt, en het blijkt een van de meer frequente vormen van CDG te zijn, gekenmerkt door o.a. verstandelijke beperking en obesitas. Het MAN1B1 enzym bevindt zich normaal in het Golgi compartiment en heeft wellicht een functie in het herkennen en verwerken van foutief gevouwen glycoproteïnen. Deze worden in normale omstandigheden teruggestuurd naar het endoplasmatisch reticulum voor afbraak. Onze hypothese is dat de MAN1B1 deficiëntie aanleiding geeft tot een opstapeling van foutief gevouwen glycoproteïnen in het Golgi, waardoor de capaciteit van dit compartiment wordt overtroffen. In preliminaire experimenten hebben we aangetoond dat de Golgi trafiek en de morfologie sterkt afwijkend zijn in cellen die MAN1B1 missen." "Systematische zoektocht naar nieuwe defecten en een klinische vergelijking van congenitale glycosylatiestoornissen type 1 (CDG-I)." "Gert Matthijs" "Departement Menselijke Erfelijkheid" "Glycosylatie is één van de meest voorkomende post-translationele modificaties in de natuur. Glycosylatie is het resultaat van een goed gecoördineerde samenwerking tussen eiwitten die instaan voor de opbouw en modificatie van oligosachariden en voor hun aanhechting aan eiwitten en lipiden. Het belang van glycosylatie wordt geïllustreerd door een groep van aandoeningen, genaamd Congenitale glycosylatiestoornissen (CDG). Vandaag de dag zijn er bijna 100 verschillende aandoeningen gekend, waarbij zowel defecten in de N- en O-gebonden eiwit glycosylatie, als defecten in de synthese van GPI-ankers en glycolipiden werden gedocumenteerd. Gezien de mogelijkheid bestaat om te screenen voor deficiënties in de N-gebonden eiwit glycosylatie door middel van isoelektrische focusering van serum transferrine, richtte dit project zich op deze subgroep van aandoeningen.De genetische heterogeniteit van CDG, maar ook de klinische overlap tussen de verschillende aandoeningen is merkwaardig. Een klinische ‘hit and run’ diagnose vormt bijgevolg dus eerder de uitzondering dan de regel. Daarom is het ook moeilijk om in patiënten met een biochemisch bewezen glycosylatie defect, de genetische oorzaak te achterhalen. In dit manuscript probeerden we het knelpunt, gevormd door gen per gen na te kijken door middel van Sanger sequencing, te omzeilen met behulp van de nieuwe generatie van genetische technieken (Hoofdstuk 3).Met het doel om nieuwe CDG genen te ontdekken, werd exoom sequenering uitgevoerd in 24 personen met een verondersteld defect in de N-gebonden eiwit glycosylatie (Hoofdstuk 4 en 5). Telkens een genetische variant werd geïdentificeerd, werd de pathogeniciteit bevraagd door middel van celbiologische experimenten. Op deze manier werd een genetische diagnose verkregen in 9 patiënten (38%) en werd een kandidaat gen geïdentificeerd in 7 patiënten (30%).Gelijktijdig werd een doelgerichte test ontwikkeld die 79 genen gelijktijdig kan nakijken op varianten, om zo de efficiëntie van de CDG diagnostiek te bevorderen (Hoofdstuk 6). Gedurende een periode van 2 jaar, werd de test toegepast op stalen van 86 patiënten met een verondersteld defect in de N-gebonden eiwit glycosylatie. Op deze manier kon relatief snel een definitieve genetische diagnose gesteld worden in 38 patiënten (44%). Op basis van deze resultaten werd een nieuw stroomdiagram voor CDG diagnostiek voorgesteld.In deze studie leidde exoom sequenering eveneens tot de identificatie van een nieuwe CDG-II, veroorzaakt door mutaties in MAN1B1. Op basis van de biochemische afwijkingen geobserveerd in de index, werden 18 bijkomende patiënten gediagnosticeerd met mutaties in hetzelfde gen. Alle patiënten vertoonden gelijkaardige klinische kenmerken zoals mentale retardatie, vertraagde motorische en spraakontwikkeling, hypotonie, macrocefalie en obesitas.Tijdens het verloop van dit doctoraat, werd de intracellulaire lokalisatie van MAN1B1 het onderwerp van een nog steeds lopend debat. Naast de functie van MAN1B1 in de maturatie van N-glycanen, wordt dit enzym ook verondersteld een belangrijke rol te spelen in de kwaliteitscontrole binnen het ER, door foutief geplooide eiwitten te markeren voor proteasomale degradatie. Aangezien alle andere spelers van ERAD zich in het ER bevinden, leek het niet meer dan logisch dat ook MAN1B1 zijn functie in dit organel zou uitvoeren. Vandaag de dag zijn de meningen hieromtrent echter verdeeld. Daar waar sommige onderzoekers nog steeds geloven dat MAN1B1 zich in het ER bevindt, zijn anderen ervan overtuigd dat het enzym functioneert in een verondersteld ERQC compartiment of zelfs in het Golgi apparaat.In Hoofdstuk 9 hebben we duidelijk kunnen aantonen, dat in primaire huidfibroblasten endogeen MAN1B1 in het Golgi apparaat gelokaliseerd is. Hiermee bevestigden we de initiële, doch nog steeds controversiële resultaten van Sifers en zijn collega’s. Onze bevindingen werden bijkomend ondersteund door de observatie dat MAN1B1-deficiënte fibroblasten een abnormale Golgi structuur vertonen en dit zonder de aanwezigheid van een stress reactie in het ER (Hoofdstuk 8 en 9).In het verleden werden MAN1B1-deficiënte cellen voornaam gebruikt om het lot van verkeerd geplooide eiwitten te bestuderen. Met betrekking tot het fenotype van MAN1B1-CDG waren we echter voornaam geïnteresseerd in de gevolgen van MAN1B1-deficiëntie op correct geplooide eiwitten (Hoofdstuk 9). Op deze manier konden we aantonen dat MAN1B1-deficiëntie niet alleen leidt tot de accumulatie en partiële secretie van foutief geplooide eiwitten, maar dat deze deficiëntie ook het anterograad transport van correct geplooide eiwitten negatief beïnvloedt.In Hoofdstuk 10 van dit manuscript veronderstelden we dat de bovengenoemde accumulatie van al dan niet correct geplooide eiwitten in het Golgi apparaat de secretoire capaciteit van dit organel zou kunnen belasten, resulterend in een primaire Golgi stress respons. Op basis van verschillende pilootexperimenten konden we aantonen, dat MAN1B1-deficiëntie een milde tot matige transcriptionele respons genereert, die niet enkel uniform aanwezig was tussen de verschillende MAN1B1 patiënten onderling, maar die ook verschillend was van de respons die in andere CDG-II cellijnen waargenomen werd. Aanvullende experimenten dienen in de toekomst uitgevoerd te worden om de omvang van een eventuele Golgi stress respons in MAN1B1-CDG te beschrijven en om de eventuele impact van deze respons op de behandeling van MAN1B1-CDG patiënten te kunnen evalueren." "Aangeboren glycosilatiestoornissen" "Gert Matthijs" "Departement Menselijke Erfelijkheid" "Glycosylering is een chemische modificatie van eiwitten in onze cellen. Het beïnvloedt hun stabiliteit en functie. Duizenden eiwitten zijn ‘glyco-eiwitten’. Als gevolg hiervan leiden genetische defecten in glycosyleringsroutes tot meestal ernstige ziekten, genaamd ‘Congenital Disorders of Glycosylation’ (CDG). Met meer dan 100 verschillende soorten is CDG een indrukwekkende groep stofwisselingsziekten geworden. Enerzijds hebben we patiënten met duidelijke glycosyleringsanomalieën, van wie de genetische defecten ongrijpbaar blijven. We zijn van plan om genomische tools te gebruiken om nieuwe genen en nieuwe ziektemechanismen te identificeren. Aan de andere kant zijn we van mening dat veel andere patiënten met symptomen die passen bij CDG (zoals verstandelijke handicaps, meerdere aangeboren afwijkingen, bloedingsstoornissen enz.), Mogelijk een glycosyleringsstoornis hebben die momenteel aan diagnose ontsnapt omdat de diagnostische hulpmiddelen onvoldoende zijn. We zullen nieuwe biomarkers ontwikkelen op basis van glycomics, glycopeptidomics en metabolomics. Bovendien kan fundamenteel onderzoek naar de biochemie van suikers leiden tot de identificatie van volledig nieuwe soorten ziekten. Het uiteindelijke doel is om CDG-patiënten te behandelen of te genezen. Omdat de cellulaire compartimenten waar glycosylering optreedt, niet gemakkelijk kunnen worden bereikt met therapeutische verbindingen, is een oorzakelijke behandeling moeilijk. Daarom is een beter begrip van de pathofysiologie van de verschillende soorten CDG cruciaal voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies. Daartoe zullen we systematisch reeds beschikbare cel- en muismodellen bestuderen met behulp van state-of-the-art omics-benaderingen. EUROGLYCAN-omics brengt een multidisciplinaire groep klinische en fundamentele onderzoekers samen die bewezen hebben samen te kunnen werken. In het belang van de patiënten en hun families willen we de ambitieuze doelen bereiken die hier zijn gesteld."