Titel Promotor Affiliaties "Korte inhoud" "Regeneratie en zonering door ZEB2 van lever-endotheel" "Aernout Luttun" "Centrum voor Moleculaire en Vasculaire Biologie" "The liver is a crucial organ in metabolism and removal of waste products from the body. Hereto, the liver parenchyma receives a mix of nutrient-rich blood from the portal vein and oxygen-rich blood from the hepatic artery. Blood flows through the sinusoids and leaves the liver via the central and hepatic veins. Hepatic sinusoids are highly specialised channels in which hepatocytes are organised in zones according to their position relative to the portal and central veins. They are lined with a specified, fenestrated, discontinuous endothelium. Many drugs (e.g., chemotherapeutics) and toxins cause damage to the sinusoids that may lead to liver fibrosis and cirrhosis. Formation of new sinusoids is an indispensible step for liver regeneration. Furthermore, liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) produce agents that stimulate hepatocyte proliferation. Time-dependent expression of different proteins in the developing liver is important for sinusoid formation. The host lab found that the transcription factor Zeb2 (also known as Sip1) is highly expressed in LSECs in the developing and adult liver. Furthermore, its expression in adult LSECs is mainly in those from the pericentral zone. We hypothesize that Zeb2 is a transcriptional determinant of LSEC specification, zonation, maintenance and regeneration. Here, we aim to:evaluate whether/how Zeb2 contributes to LSEC specification and zonationestablish a role for Zeb2 in LSECs in adult miceassess its role in sinusoidal regeneration during liver diseaseestimate the therapeutic potential of Zeb2-treated endothelial progenitors in recovery from liver injury.To address these aims, we will use a multidisciplinary approach based on lentiviral overexpression in cultured ECs, transgenic mice lacking or overexpressing Zeb2 in ECs and transplantation of ECs pre-specified towards LSECs. These studies will allow us to evaluate the potential of Zeb2 as a novel target to stimulate liver regeneration." "Impact van Zeb2 op specificatie, zonatie en regeneratie van lever sinusoïdaal endotheel" "Aernout Luttun" "Centrum voor Moleculaire en Vasculaire Biologie" "Lever-sinusoïdale endotheelcellen (LSEC's) zijn een zeer gespecialiseerd type endotheelcellen (EC's) die worden gekenmerkt door een hoge permeabiliteit als gevolg van de aanwezigheid van transcellulaire poriën, fenestraties genoemd, een slecht ontwikkeld basaalmembraan, en hoge expressieniveaus van wegvangende receptoren. Vanwege deze hoge permeabiliteit en hun positie op het grensvlak tussen bloed en hepatocyten, fungeren LSEC's als een selectieve filter van het bloed, waardoor transport van voedingsstoffen naar de hepatocyten mogelijk is en tegelijkertijd afvalstoffen en binnendringende pathogenen worden opgeruimd. Tegelijkertijd maakt hun strategische positie LSEC's ook kwetsbaar, wat wordt weerspiegeld door hun snelle dedifferentiatie tijdens chronische leverziekte naar een continu capillair EC-fenotype, een proces dat bekend staat als capillarisatie, vergezeld van LSEC-disfunctie. LSEC-capillarisatie is een belangrijke katalysator van de progressie van chronische leverziekte. Hoewel het herstellen van de LSEC-specialisatie een veelbelovende strategie is voor chronische leverziekten met verschillende etiologieën, staat het begrijpen van de moleculaire regulatie ervan nog maar in de kinderschoenen.Het meest voorkomende type chronische leverziekte is tegenwoordig niet-alcoholische leververvetting (NAFLD). NAFLD heeft wereldwijd een prevalentie van ~30%. Vanwege de nauwe relatie met het metabool syndroom en obesitas neemt de prevalentie ervan echter nog steeds toe. NAFLD is verantwoordelijk voor 4% van alle sterfgevallen en wordt de belangrijkste oorzaak van levertransplantaties. Helaas bestaan er geen effectieve farmacologische behandelingen, waardoor patiënten worden overgegeven aan ondersteunende therapie en aanmoediging voor gewichtsverlies en leefstijlinterventies. NAFLD vertegenwoordigt een spectrum van chronische leverziekten, bestaande uit steatose in de beginfase, die kan evolueren naar de inflammatoire fase van niet-alcoholische steatohepatitis (NASH), die fibrose veroorzaakt. In het eindstadium van chronische leverziekte ontstaat cirrose, gekenmerkt door angiogenese om portaal-systemische shunts en regeneratieve knobbeltjes te vormen. LSEC's zijn betrokken bij alle belangrijke pathologische processen van de progressie van chronische leverziekte, via cel autonome en niet cel autonome mechanismen.Transcriptiefactor ZEB2, goed beschreven in ontwikkeling en kanker vanwege zijn rol in respectievelijk neuronale differentiatie en endotheel-naar-mesenchymale transitie, was een van de transcriptiefactoren die eerder door mijn gastlaboratorium werden geïdentificeerd als een potentiële regulators van LSEC-specialisatie vanwege de verrijking ervan in lever vergeleken met hart- en hersen-EC's. We besloten te onderzoeken of ZEB2 inderdaad belangrijk is voor LSEC-specialisatie tijdens basale omstandigheden, fibrose en steatose. Daarom hebben we de ZEB2-expressie specifiek gemanipuleerd in EC's van EC-specifieke Zeb2 knock-out (ECZeb2KO) of overexpressie (ECOE) muizen. Om de rol ervan tijdens chronische leverziekte te bestuderen, hebben we een door toxines geïnduceerd fibrosemodel en een door westers dieet (WD) geïnduceerd model van NAFLD gebruikt.Sequencing van lever-EC-RNA vroeg na het verwijderen van ZEB2 onthulde een toename van continue EC-markers, wat suggereert dat Zeb2-deficiënte LSEC's gevoeliger zijn voor dedifferentiatie en capillarisatie. Na ZEB2-deletie verdwenen de fenestraties echter niet. Terwijl functionele annotatie op differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) 2 weken na inductie met tamoxifen verhoogde bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF)-B-signalering en angiogenese liet zien, maar geen proliferatie, was verhoogde proliferatie de overheersende functionele annotatie 6 weken na Zeb2-deletie, wat waarschijnlijk een weerspiegeling is van verschillende vormen van angiogenese veroorzaakt door endotheliale Zeb2-deletie. Hiermee gepaard ging een uitbreiding van het vasculaire oppervlak en de aanwezigheid van pilaartjes in de levervaten van ECZeb2KO gaf aan dat dit waarschijnlijk te wijten was aan verhoogde splitsende angiogenese. Hoewel shRNA-gemedieerde ZEB2-knockdown in HUVECs de proliferatie niet beïnvloedde, beïnvloedde het wel het aantal vertakkingspunten en vertakkingslengte gevormd door HUVECs, die parameters zijn die eerder geassocieerd zijn met kiemende angiogenese. Samenvattend hebben we ZEB2 geïdentificeerd als een nieuwe multimodale regulator van LSEC-identiteit.Veranderingen in de endotheliale expressie van liganden die mogelijk betrokken zijn bij het in rust houden van hepatische stellaatcellen (HSC), samen met significante veranderingen in het expressieprofiel van HSC's, toonden aan dat Zeb2 de LSEC-HSC-communicatie en HSC-activering reguleert. Dienovereenkomstig vertoonden de levers van ECKO-muizen bij blootstelling aan het hepatotoxine koolstoftetrachloride (CCl4) verhoogde capillarisatie, HSC-activering en fibrose vergeleken met levers van wildtype (WT) nestgenoten. Het vasculaire onderhoud en de anti-fibrotische rol van Zeb2 in EC’s werd bevestigd in ECOE-muizen, omdat de laatste resulteerde in verminderde vascularisatie en CCl4-geïnduceerde leverfibrose.Om de rol van ZEB2 in LSECs tijdens NAFLD te bestuderen, hebben we ECZeb2KO-muizen een WD- of standaarddieet (SD) gegeven. In gezonde en zieke WT-levers werd Zeb2 alomtegenwoordig en op vergelijkbare wijze tot expressie gebracht in de bloedvasculaire EC’s. Uit RNA-sequencing van lever-EC’s bleek dat Zeb2-deficiëntie grote veranderingen in de genexpressie teweegbrengt vergelijkbaar met die veroorzaakt door kortdurende WD-voeding. Functionele annotatie op DEG's onthulde dat deze veranderingen in genexpressie gerelateerd zijn aan celdeling en Rho GTPase-signalering. Immunofluorescentiekleuring voor KI67 bevestigde een verhoogde proliferatie in LSEC's na ZEB2-verlies, WD-voeding of de combinatie van beide. Bovendien werkten endotheliale ZEB2-verlies en WD-voeding samen om de capillarisatie te stimuleren, wat blijkt uit de sterk beïnvloede LSEC-markerexpressie. Functionele annotatie op DEG's die voortkomen uit de interactie van ZEB2-verlies en WD-voeding onthulde specifiek veranderingen in genexpressie gerelateerd aan 'peroxisoom proliferator geactiveerde receptor (PPAR) signalering' en de 'complement- en coagulatiecascade'. Dit laatste vertegenwoordigt een aspect van EC-disfunctie en werd aangetoond door verminderde F8-expressie en verminderde bloedstolling. Intrigerend genoeg onthulde de veranderde communicatie tussen LSEC's na gecombineerd endotheliaal ZEB2-verlies en WD-blootstelling vergelijkbare functionele gevolgen. Opmerkelijk is dat Peptidylarginine deiminase 4 (Padi4), het gen dat codeert voor een enzym dat voornamelijk wordt beschreven bij de vorming van neutrofiel extracellulair web, naar voren kwam als een gen kenmerkend voor vroeg stadium leverziekte met citrullinatie-activiteit geïnduceerd door kortdurende WD-voeding en ZEB2-verlies in LSEC's. Ondanks dat het verhoogde tekenen van LSEC-capillarisatie veroorzaakte, corrigeerde endotheliaal ZEB2-verlies uiteindelijk de door WD geïnduceerde hypovascularisatie van het leverparenchym, terwijl de gewichtstoename, leverbeschadiging en steatosis afnam.Concluderend induceert endotheliaal ZEB2-verlies LSEC-capillarisatie en angiogenese tijdens fysiologische omstandigheden. In de context van door toxines geïnduceerde leverfibrose versnelt ZEB2-verlies in EC's de fibrogenese van de lever, terwijl het de ontwikkeling van steatose vermindert in een model van NAFLD. Tijdens NAFLD vermindert endotheliale Zeb2-deficiëntie de ontwikkeling van steatosis mogelijk door het LSEC-vetmetabolisme te stimuleren. Vanwege de contextafhankelijke rol van ZEB2 in EC’s is verder onderzoek nodig om te ontcijferen of remming of stimulatie van ZEB2 het gunstigst zou zijn voor de uitkomst van de ziekte, voordat ZEB2 en ZEB2-afhankelijke genen in lever-EC's worden benut om nieuwe therapeutische strategieën voor leverfibrose of -steatose te ontwerpen." "In vitro functionele vorming van leversinusoïdale endotheelcellen in 3D-kweeksysteem." "Frederic Lluis Vinas" "Stamcel- en Ontwikkelingsbiologie" "Leversinusoïdale endotheelcellen (LSEC's) zijn zeer gespecialiseerde endotheelcellen die de barrière vormen tussen het bloed en hepatocyten en hepatische stellaatcellen (HSC's). LSEC's hebben geen basaalmembraan en zijn voorzien van fenestraties, waardoor macromolecuultransport door deze barrière mogelijk is. Bij leverontsteking dedifferentiëren LSEC's (ook wel sinusoïdale capillarisatie genoemd), vormen ze een basismembraan en verliezen ze fenestra, wat de fibrose verder bevordert. Tijdens de ontwikkeling spelen LSEC's een rol bij de differentiatie en rijping van hepatocyten. Bovendien hebben LSEC's het vermogen om hepatitis B-virus (HBV), hepatitis C-virus (HCV), ebolavirussen, adenovirussen, HIV en coronavirussen te verwijderen via de CD209- en CD209L-patroonherkenningsreceptor. Gezien de rol van LSEC's en hun overspraak met andere (niet-) parenchymale leverceltypen in zowel homeostatische als pathologische aandoeningen, is het cruciaal om LSEC's op te nemen in co-cultuurmodellen van de lever. Het is echter bekend dat primaire LSEC's hun kenmerken, zoals fenestrae en endocytische capaciteit, binnen 1-2 dagen na in vitro kweek verliezen. Bovendien is de beperkte beschikbaarheid van menselijke primaire LSEC's een groot obstakel voor voortgang LSEC-onderzoek. In dit project willen we gebruik maken van transcriptiefactor (TF) geleide differentiatie en een 3D in vitro LSEC model afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hiPSCs) om betere lever in vitro modellen te bekomen." HeMiBio "Leo A van Grunsven" "Celbiologie en Histologie" "In HeMiBio, the aim was to create a bioreactor culture system of hepatocytes alone or in combination with the non-parenchymal fraction of the liver (hepatic stellate cells (HSCs) and liver sinusoidal endothelial cells (LSECs)) to allow repeated toxicity testing of cosmetics and chemicals for up to 2-3 weeks in vitro. In the project we made the following advances beyond the state of the art: 1. CELLS: We characterized for the first time human primary HSCs and LSECs at the functional and transcriptional level; characterized transcriptomic as well as epigenomic processes that cause activation of HSCs, and developed methods to counteract this activation; while we demonstrated that LSECs very quickly de-differentiate in culture and developed medium that can delay this event for ± 2 passages; we developed progressively improving methods to create hepatocytes from PSCs, yielding cells that can be used to study toxicants. However, despite the significant improvement in hepatocyte progeny, the cells remain less mature than primary hepatocytes. Therefore, transcriptome, epigenome and metabolome studies were performed to understand hurdles in the differentiation process, insights which were and are continuously used to improve creation of mature hepatocytes. Likewise, cells with HSC-like properties were created from hPSC. Here too the progeny is not fully similar to quiescent HSCs from the liver. Transcriptome studies confirmed this and are now being used to further improve differentiation. A similar set of studies was also done to create LSECs from either PSCs or from blood outgrowth endothelial cells. In a third set of studies, the transiently immortalized UpCyte hepatocytes were fully characterized, and were shown to have functional properties that approach those of primary hepatocytes. These UpCyte hepatocytes (generated from 5 different donors) were suitable for toxicity testing. SENSORS: In a second major set of studies, sensors to be incorporated in cells or in the bioreactor were created and tested. For cellular sensors, a genome edited set of stem cells was generated that now allows very fast recombination of any incoming cassette such as for instance the NFkB reporter. For sensors within the bioreactor, fully biocompatible microbeads equipped with an oxygen-sensitive, phosphorescent dye were incorporated within the bioreactor allowing real time detection of oxygen consumption. In addition, a novel ALT sensor was created, which can assess with high sensitivity the excretion of ALT from diseased liver cells. These sensors, combined with additional standard pH and glucose sensors were incorporated in two different switch boards/liquid handling units to allow intermittent sampling of culture fluid enabling assessment of the health of cells within the bio-reactor for protracted times. BIOREACTORS: Three different bioreactor designs were generated: (1) An antibody-based, microfluidic system: capable of patterning any biotin-conjugated set of antibodies using streptavidin-based surface chemistry, allowing the generation of arbitrary cell patterns from heterogeneous mixtures in microfluidic devices. (2) A flow-over bioreactor: this stainless steel bioreactor protects hepatocytes from shear forces while creating stable oxygen and nutrient gradients mimicking the in vivo zonated liver. We demonstrated that HepG2/C3A cells could be maintained for over 28 days in vitro, while displaying over 98% viability and high expression of liver specific markers including CYP450 enzymes. (3) A flow-through bioreactor: although very challenging, significant progress was made towards producing a 3D COC-based bioreactor for liver cell culture, and most technological hurdles in producing prototype reactors were overcome. Further testing will be needed to ensure cell viability. TOXICITY TESTING: The ultimate goal was to exploit the technologies, in toxicity studies. UpCyte hepatocytes and PSC hepatocytes were shown to be suitable for testing molecules shortlisted by the SEURAT-1 consortium on the gold compound list. A significant amount of work has also gone to develop an in vitro model for liver fibrosis, using co-cultures of HSCs and hepatocytes. These cocultures can identify fibrosis inducing drugs, as deposition of cross linked collagens can be detected following e.g. repeat dose exposure to methotrexate, a premier liver fibrosis inducing drug, among others. In conclusion: HeMiBio has developed numerous tools towards the creation of innovative bioreactors, including cells, sensors and the reactors themselves to allow 2-3 week culture of hepatocytes with or without non-parenchymal cells to study the effect of drugs from the gold-compound list from SEURAT-1 and to for the first time allow assessment of liver fibrosis inducing drugs. Project Context and Objectives: Refinement, Reduction and Replacement of the use of animals in toxicity tests is of particular importance for the implementation of relevant EU policies, such as the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) Regulation or the Cosmetics Directive (76/768/EEC). Although multiple projects had been funded by the EC aimed at decreasing the need for animals in toxicity testing before the start of the HeMiBio project, the assessment of toxic effects of chronic exposure still required and requires a relatively high consumption of animals. Moreover, aside from these ethical considerations, there was also a great need for suitable human cells to be used in toxicity testing, due to the often poor concordance seen between animal models and toxic effects in humans. HeMiBio proposed to generate a liver-simulating device mimicking the complex structure and function of the human liver. The device should reproduce the interactions between parenchymal (hepatocytes) and non-parenchymal (hepatic stellate cells (HSC), and hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC) cells of the liver for over 1 month in vitro in a high-throughput format. Such a Hepatic Microfluidic Bioreactor should serve to test the effects of chronic exposure to chemicals, including cosmetic ingredients. We postulated that to recreate a liver-simulating device suitable for long-term toxicity testing, (1) the cellular components of the liver need to be viable for extended periods of time (more than 1 month), with appropriate metabolic and transport function, and physiology that is comparable to the in vivo liver; (2) the device should allow fluid to flow over or even through the mixed cells that recreate a small liver section; (3) recreate the differences in function of hepatocytes and non-parenchymal liver cells depending on where they are localised near the artery or vein of in the liver; (4) assess the role of the non-parenchymal cells on the function and downstream toxicity of the hepatocytes, such as is the case in liver fibrosis. Such a device should be able to (iv) screen drug-drug interactions as well as long-term toxicity of chemical entities. WHAT WAS KNOWN AT THE START OF HeMiBio: It was/is believed that culture systems that incorporate hepatocytes as well as the non-parenchymal cellular components of the liver could be created to provide clinically relevant information on not only short-term but also mid/long-term drug clearance and drug toxicity of chemicals, i.e. over a period of at least one month, which can be used in the cosmetics industry. However, no reactor has yet been created that can indeed fulfil all criteria set forth above. Several culture methods have been evaluated, from simple cultures of hepatocytes in 2D- on extra-cellular matrix (ECM), to sandwich cultures where hepatocytes are cultured between two layers of ECM and 2D-flat membrane bioreactors, to co-cultures of different liver cell components in 2D-culture systems, and ultimately more complex 3D-culture and bioreactor systems, consisting of multiple or single compartments wherein the different liver cell components are co-cultured together. With increasing complexity, hepatocyte function is maintained better, whereas the less complex culture systems are more amenable to studying the mechanisms that control maintenance of cellular function. These studies demonstrated that (1) co-culture of the different cellular compartments of the liver improves the long-term stability of hepatocytes as well as the non-parenchymal cells in vitro, which may ultimately lead to (2) the ability to use such devices for testing the effect of toxins directly on hepatocytes, or via their effects on the non-parenchymal component of the liver on the function and clearance ability of hepatocytes. Features of a liver-simulating device that play a role in the functionality of the device include (a) the matrix whereupon cells are maintained, (b) oxygenation, (c) shear flow, (d) transport phenomena, (e) the combination of cells included, (f) distance between the different cellular components, among others. THE UNDERLYING HYPOTHESIS The hypothesis for the successful creation of a 3D liver -simulating device suitable to test repeated toxicity was that (1) parenchymal (hepatocytes) and non-parenchymal cells (LSEC, HSC) need to be combined. (2) cellular interactions between the different components are required to maintain the functional, differentiated and quiescent state of both the parenchymal and non-parenchymal cell component. (3) matrix whereupon cells are maintained, oxygenation, nutrient transport needs to be optimized to support long-term maintenance of parenchymal and non-parenchymal function (4) the system needs to be built such that repeated on-line assessment of cellular integrity, as well as metabolic and transport function, and physiology of the different cellular components is possible. To achieve the creation of a bioreactor taking into account these hypotheses, the specific objectives were therefore: 1. Engineer the different cellular components required for the development of a 3D-bioreactor (WP1-2) to: (1) allow specific and spatially defined enrichment of the different cell components, using specific antibodies/ligands. (2) allow non-invasive detection by fluorescence read-outs of the cellular state ( To accomplish this the following tools would have to be generated: a. Use PSC-derived progeny (hepatocytes, LSEC or HSC) b. We would also assess if cells other than pluripotent stem cells could be used to populate the liver device, including primary stellate cells, primary liver sinusoidal endothelial cells, or cells that have been transiently immortalized using the Medicyte (UpCyte) technology. c. Use micropatterned cell-specific antibodies that would allow spatially specific immobilization of the different cell components in 2D-laminar flow in microfluidic devices and, if needed, also 3D-bioreactors. d. We would knock in targeting constructs that code for fluorescent proteins and 3’ from selected genes characteristically expressed in terminally differentiated cells, to assess in vivo and in real-time cell fate and allow reselection of cells from reactors. e. We would knock in cell damage-specific expression cassettes (e.g. based on the activation of NF-κβ, ...) in the AAVS1 region, to assess in vivo and in real-time cell damage. This should ultimately make it possible to determine which of the cell types in the liver-simulating device undergoes cell stress/death due to a given toxin. OBJECTIVE 1: HeMiBio aimed to develop tools to engineer the cellular components for the bioreactor: to allow specific and spatially defined enrichment of the different cell components; to non-invasively and in real-time assess the differentiation state of the parenchymal and non-parenchymal cells as well as cell damage. 2. Generate innovative sensing tools that would allow for non-invasive detection of the cell state/fate: this would include biological fluorescent sensors for the dynamic readout of cell function and health (see objective 1, above). In addition, we would generate a combination of electro-chemical sensors to be embedded in the bioreactor to provide continuous measurement of liver-specific function and cellular health. These might include glucose, oxygen, potassium, ammonium, and ALT sensors. Such sensors should be able to dynamically assess the health/activation state of the different cellular compartments in a high-throughput format and provide critical information regarding long-term cellular function as well as repeated dose toxicity screening. OBJECTIVE 2: HeMiBio aimed to incorporate molecular sensors to dynamically measure cellular function and toxicity in a high-throughput format. High-resolution fluorescent markers will be developed and integrated in a targeted fashion into the host cell genome to detect early inflammatory and pro-apoptotic effects (see also Objective 1). In addition, innovative electro-chemical sensors, such as ion-selective electrodes, would be integrated in the 3D-bioreactors to allow assessment of liver function (e.g. oxygen uptake, ammonium, and glucose concentrations), and also the continuous assessment of cell integrity (e.g. by measurement of potassium, and ALT release due to cell death). 3. As a rapid intermediary to the complex 3D-bioreactor, 2D-isolation-patterning bioreactors would be created that allow for the efficient transition from a mixed iPSC culture to a spatially controlled organ-simulating device. In addition, a 2D flow over bioreactor would be created, wherein sensors developed are integrated in the bioreactor, providing critical insight into the evolving design of the 3D-bioreactor. In addition, this platform would also serve for the optimization of culture medium formulation for maintenance of long-term function. OBJECTIVE 3: HeMiBio would develop a 2D-bioreactor for the efficient isolation of differentiated iPSC mixtures by trapping different cell types on micropatterned surfaces. 4. The Hepatic Microfluidic Bioreactor (HeMiBio) would be developed and enhanced with the development of integrated sensors and their characterization under microfluidics. Based on an established packed-bed bioreactor design previously shown to support the function of primary hepatocytes for over a week, HeMiBio would support physiological-level perfusion of self-assembled hepatic organoids in an individually addressable microfluidic array for high-throughput screening. Similar self-assembled hepatic organoids were shown to support liver-specific function of primary hepatocytes for over 40 days under static conditions. The device will be further fitted with our biological and chemo-electrical sensors that provide dynamic high-throughput assessment of cellular function and health. OBJECTIVE 4: HeMiBio would generate a liver-simulating device mimicking the human liver, which reproduces the function of the parenchymal (hepatocytes) and non-parenchymal (HSC and HSEC) liver cells over 1 month in culture. This will be accomplished by combining engineered cells and the electrophysical sensors. The liver-simulating device created in HeMiBio will thus allow for the dynamic monitoring of cellular function and health in a high-throughput format under numerous conditions. 5. During the final years of HeMiBio, proof-of-concept studies would be performed to assess the effect of known chemical entities on the cellular components of the liver-simulating device. The choice of compounds to be tested would be adapted throughout the tenure of HeMiBio based on studies from the SEURAT-1 cluster. The HeMiBio platform was composed of not only hepatocytes but also non-parenchymal cells, and should therefore be very well suited to study toxicants that cause liver fibrosis, which is due to the activation of HSCs that form scars, and then lead to the death of hepatocytes. OBJECTIVE 5: HeMiBio will provide proof-of-principle that a liver-simulating device can recreate the toxicity profile in vitro of toxins with a known in vivo toxicity profile over a minimum of 1 month, with specific emphasis on liver fibrosis 6. Throughout WPs 1, 3, 4 and 5, we planned to assess the phenotype of the different cellular components using a combination of transcriptomics, epigenomics and metabolomics. At all stages of reactor assembly, the functional properties of the different cell populations would be assessed using state-of-the-art functional assays. We hypothesized that the phenotype of the parenchymal and non-parenchymal cell components would be more similar to that of primary liver-derived cells when cells were cultured in 2D-cultures, compared with cells isolated from the liver/blood and cultured separately or cells generated under the established iPSC-liver differentiation cultures; and that the phenotype of the two cell compartments of the liver maintained in 3D-cultures would approach that of primary liver isolates even further. OBJECTIVE 6: HeMiBio planned to assess the molecular, functional and metabolic phenotype of the hepatocellular, HSEC and HSC components at all stages of bioreactor development, and compare this with that of cells isolated fresh from human livers." "Genen en mechanica: hoe weefselspecifieke endotheelcel heterogeniteit ontstaat" "Hans Van Oosterwyck" "Biomechanica (BMe), Centrum voor Moleculaire en Vasculaire Biologie" "Bloedvaten zijn veel meer dan eenvoudige leidingen voor bloedstroming. Ze zijn in staat om de uitwisseling tussen bloed en weefsels actief te sturen. Daardoor zijn ze niet dezelfde in alle weefsels. Het zijn deze weefselspecifieke verschillen die de functie van bloedvaten controleren en daarom is het essentieel dat we begrijpen hoe deze weefselspecifieke verschillen ontstaan als we ooit in staat willen zijn om bloedvaten te engineeren voor specifieke organen. Terwijl onderzoekers de genetische controle van endotheelcel differentiatie reeds bestudeerden, is de rol van de mechanische omgeving in het instrueren van differentiatie onbekend. Het consortium heeft unieke methodieken ontwikkeld om de interactie van endotheelcellen met hun mechanische omgeving te bestuderen. Het consortium beschikt tevens over belangrijke resultaten in verband met de genetische signalen die betrokken zijn bij de weefselspecifieke differentiatie. We stellen voor om de wisselwerking tussen mechanische en genetische signalen tijdens endotheelcel differentiatie te bestuderen, om op die manier te kunnen begrijpen hoe endotheelcellen geprogrammeerd zijn voor hun weefselspecifieke functie." "BruStem: Regeneratieve geneeskunde van de lever met synergetische mengsels van onvolwassen of volwassen menselijke hepatocyten met mesenchymale stamcellen/voorlopercellen of met hepatische Notti cellen." "Etienne Sokal, Leo A van Grunsven" "Université catholique de Louvain, Fysiologie, Toxicologie, Dermato-cosmetologie en Farmacognosie, Celbiologie en Histologie" "Het doel van dit project is het onderzoeken van alternatieve celkandidaten voor regeneratieve lever geneeskjunde. Mesenchymale stam/progenitor cellen van intra en extrahepatiscbe bronnen zijn specifiek onderzoek met betrekking tot hun proliferatie en hepatogenische differentie potentieel. Lever Notti cellen zullen ook onderzocht worden en ontwikkeld voor de screening van anti-fibrogenische medicatie." "Leverprogenitorcellen, hun secretoom en lever reparatie" "Leo A van Grunsven" "Celbiologie en Histologie" "Chronische leverziektes, leverprogenitorcellen" "Het verband tussen hypoxie en progenitor cellen bij carcinogenese in de lever" "Geen naam beschikbaar, Leo A van Grunsven" "Ghent University, Celbiologie en Histologie" "Elk jaar worden bijna een half miljoen mensen gediagnosticeerd met een primaire lever tumor. In dit onderzoek zouden we de invloed van hypoxie (lage zuurstof niveau's) en verminderde zuurstof niveau detectie op lever stamcellen willen beoordelen, evenals hoe dit deze zaken een invloed kunnen hebben op de ontwikkeling van levertumoren." "Modulatie van leverfibrose door liposoomgemedieerde selectieve gerichtheid van leverstellaatcellen" "Leo A van Grunsven" "Celbiologie en Histologie" "Studie rond leverfibrose" "Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) specifiek voor type 1 myotone dystrofie: een innovatief platform voor myogene en cardiomyogene differentiatie en validatie van nieuwe therapeutische strategieën" "Marinee Chuah" "Celbiologie en Histologie" "Myotone dystrofie type 1 (DM1) of de Ziekte van Steiners is een relatief gewoon genetische stoornis dat resulteert in een graduele degeneratie van de werking van skeletspieren en het hart. Het doel van dit project is een beter begrip te krijgen van hoe het toxische gen product zich mengt met de normale celwerking en een nieuwe therapie die zich toespitst op het neutraliseren van dit toxisch effect, te valideren."