Titel Affiliaties "Korte inhoud" "Integratie van Notch signalisatie in humane T cel differentiatie" "Vakgroep Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie" "Notch signalisatie is essentieel voor het generen van immuuncompetente T lymfocyten uit hematopoietische stamcellen. Echter,deze pathway op zich is onvoldoende om T cel ontwikkeling te sturen. In dit project bestuderen we de rol van de individuele componenten van de Notch pathway en de interactiepartners die samen met Notch de drijvende kracht zijn van humane T cel ontwikkeling." "Een genetische aanpak voor de studie van Notch signalisatie in normale en maligne hematopoiëse bij de mens" "Tom Taghon" "Vakgroep Diagnostische Wetenschappen, Vakgroep Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie" "Het immuunsysteem is ons lichaam het belangrijkste afweermechanisme tegen binnendringende pathogenen, evenals tegen tumorcellen. Een van de kritische witte bloedcellen die een centrale rol in het immuunsysteem speelt zijn T-lymfocyten, cellen die zijn gegenereerd uit bloedvormende stamcellen door middel van een proces dat wordt aangedreven door de Notch-signaleringsroute. In een aantal klinische gevallen, bijvoorbeeld na radio- en / of chemotherapie voorafgaand aan celtransplantatie of in geval van HIV-infectie tegen te gaan, hebben patiënten T-cel aantallen verminderd, waardoor ze zeer gevoelig voor infecties. Het verstrekken van dergelijke patiënten met meer stamcellen met een hoge T-cel potentieel, of met functioneel volgroeide T-cellen zou het herstel van het immuunsysteem verbeteren en het genereren van nieuwe therapeutische doorbraken. Echter, om deze na te streven, moeten we onze kennis uit te breiden naar de moleculaire mechanismen die de ontwikkeling van menselijke stamcellen en T-lymfocyten te controleren en dit is het eerste doel in dit onderzoeksvoorstel. Met behulp van innovatieve technologieën, zullen wij specifiek onderzoek naar de rol van de Notch-signaleringsroute in stamcellen en T-cel ontwikkeling. Aangezien activerende mutaties in de Notch pathway resultaat bij T-cel tumoren, willen we een humaan model van deze-Notch gedreven ziekte genereren om de moleculaire mechanismen die deze oncogene proces bemiddelen begrijpen. Dit is essentieel voor de ontwikkeling van om nieuwe therapeutische targets te verbeteren en dit is het tweede doel van dit voorstel." "Karakterisatie van Notch gemedieerde humane intrathymus T cel differentiatie" "Tom Taghon" "Vakgroep Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie" "T-cellen spelen een cruciale rol in het immuunsysteem en daarom is het van klinisch belang om hun ontwikkeling beter te begrijpen. Tijdens dit ontwikkelingsproces spelen Notch receptor-ligand interacties een essentiële rol en een strikte regulatie hiervan is belangrijk voor optimale T-cel differentiatie, alsook om tumor vorming te verhinderen. Daarom willen we de preciese werking van de Notch pathway ontrafelen." "Glycosylation of angiogenic factors by the Hexosamine Biosynthetic Pathway, a nutrient sensor with a novel metabolic-signaling role in angiogenesis?" "Mieke Dewerchin" "Laboratorium voor Angiogenese en Vasculair Metabolisme (VIB-KU Leuven)" "Bloedvaten zijn verantwoordelijk voor de aanvoer van voedingstoffen en zuurstof aan alle cellen via transport doorheen het endothelium. Deze laag bestaande uit endotheelcellen (ECn) bevindt zich aan de luminale zijde van de bloedvaten en vormt een selectieve barrière tussen het circulerend bloed en het omliggende weefsel. ECn worden gekarakteriseerd door fenotypische plasticiteit: Enerzijds zijn de ECn aanwezig in volgroeide bloedvaten in rusttoestand. Anderzijds worden ze pathologisch geactiveerd in condities zoals inflammatie, ischemie en kwaadaardige ziekten (angiogene transitie) waardoor ze gaan migreren en delen om nieuwe bloedvaten te vormen (angiogenese). Door hun onmiskenbare rol in pathologische condities zijn deze geactiveerde ECn onderwerp van intens cardiovasculair wetenschappelijk onderzoek. Recente ontwikkelingen demonstreren dat in parallel met de angiogene transitie, ook een metabole transitie plaatsvindt. Terwijl het merendeel van de wetenschappelijke studies zich tot nu toe focust op de geactiveerde ECn met als doel de angiogene activatie en bijgevolg angiogenese tegen te gaan, hebben wij beslist ons te focussen op de tegenovergestelde transitie. Daarbij trachtten we een beter overzicht te krijgen van het metabole profiel van rustende endotheelcellen en de metabole aanpassingen die gepaard gaan met de transitie naar de rusttoestand.Wanneer we kijken naar hun omgevingsomstandigheden, functionele rol en celfysiologie, observeren we onmiskenbare verschillen die er op wijzen dat geactiveerde en rustende ECn verschillende metabole noden hebben. Eerder onderzoek van het gastlaboratorium toonde aan dat geactiveerde ECn het grote merendeel van hun bio-energetische capaciteit gebruiken voor migratie en de synthese van essentiële macromoleculen zoals lipiden, eiwitten en nucleotiden die nodig zijn voor cel duplicatie. In tegenstelling tot de geactiveerde ECn  hebben de rustende ECn geen nood aan een dergelijk actief metabolisme sinds deze niet geconfronteerd worden met deze energie consumerende processen. Daarom postuleerden wij de hypothese dat een herprogrammering van het cellulair metabolisme essentieel is om de transitie van de geactiveerde naar de rust toestand te vrijwaren. In deze thesis werden diverse metaboloom -en metabole flux -analyse technieken gecombineerd met biochemische en moleculaire technieken om de aard en het mechanisme achter de transitie van de angiogene toestand naar de rust toestand te bestuderen.Dit toonde aan dat ECn cellen niet zomaar een hypo-metbolisch profiel vertonen, maar dat deze cellen een verhoogde oxidatieve pentose fosfaat flux en vetzuur b-oxidatie (FAO) vertonen. Deze bevindingen weerleggen de algemeen aanvaarde notie dat rustende cellen simpelweg hun metabolism onderdrukken.De geobserveerde metabole transitie gaat niet gepaard met verhoogde ATP of biomassa productie, maar stimuleert de productie van NADPH, reducerende factoren die essentieel zijn voor intracellulaire redox controle en de oxidatieve status van de rustende cellen verlagen. Redox controle van deze omvang is hoogst waarschijnlijk noodzakelijk om, als gevolg van het oxidatieve milieu en hoge zuurstof concentraties, de vorming van reactieve zuurstof radicalen tegen te gaan. Dit zorgt er voor dat endotheel cel activatie als gevolg van redox signalisatie in endotheelcellen verhinderd wordt en dat langdurige blootstelling tot deze radicalen, iets wat geassocieerd is met cardiovasculaire ziektes, voorkomen wordt. Een meer gedetailleerde analyse van de FAO in rustende ECn toonde aan dat FAO de NADPH productie verhoogt doordat deze metabole weg bijdraagt tot de vorming van substraat voor de NADPH producerende mitochondriale enzymen.Functioneel tonen we aan dat de FAO in rustende EC cellen essentieel is voor het onderhouden van de redox homeostase, en dat inhibitie van FAO verlies van barrière-functie veroorzaakt en leidt tot endotheliale permeabiliteit, zoals ook aangetroffen wordt in cardiovasculaire ziekten. Verder tonen we aan dat de Dll4-Notch signalering in ECn een belangrijke rol speelt als moleculaire hub welke de metabole aanpassingen tijdens de overschakeling naar de rusttoestand controleert. Meer bepaald wordt FAO rechtstreeks gereguleerd door Dll4-Notch signalering doordat NICD direct interageert met een activatie complex op de promoter van carnitine palmitoyl transferase (CPT1a), een sleutelenzyme van de FAO verantwoordelijk voor de transfer van vetzuren tot in de mitochondriën, en vervolgens de transcriptie stimuleert.Alles samengevat voorziet dit werk onweerlegbaar bewijs voor het bestaan van een metabole transitie die gepaard gaat met de endotheliale transitie van een geactiveerde toestand naar een rustende toestand, en identificeerden we een moleculair mechanisme dat deze metabole transitie reguleert. " "De oncogene JAK-STAT signaalweg in T-cel acute lymfatische leukemie en de link met epigenetische veranderingen en RNA metabolisme" "Jan Cools" "Laboratorium voor Moleculaire Biologie van Leukemie (VIB-KU Leuven)" "T-cel acute lymfatische leukemie (T-ALL) is een agressieve hematologische maligniteit, gekenmerkt door de ongecontroleerde proliferatie van onrijpe lymfocyten in het beenmerg. Hoewel de behandeling bij kinderen zeer effectief is, is er nog steeds een onvervulde medische nood. Bij recidief of refractaire ziekte en bij volwassen patiënten blijven de behandelingsresultaten en de 5-jaarsoverleving somber. De behandeling bestaat uit complexe en intensieve chemotherapieschema’s, met belangrijke behandelingsgerelateerde morbiditeit (zowel op korte als lange termijn) en mortaliteit. Ongeveer één derde van de T-ALL gevallen vertoont activatie van IL7 signaaltransductie door mutaties in de genen die coderen voor de componenten waaruit deze IL7 signaalweg is opgebouwd. Dit geeft aanleiding tot ontstaan van leukemie door rechtstreekse activatie van IL7-JAK-STAT doelgenen, via transcriptiefactor STAT5, en door activatie van bijkomende signaalwegen zoals Pi3K- en MAPK-signaalwegen. We hebben eerder aangetoond dat gerichte remming van JAK1/3 de proliferatie van JAK3-gemuteerde T-ALL-cellen zowel in vitro als in vivo afremt en synergistische activiteit heeft met PI3K-, BCL2- en MAPK-remmers. In het eerste deel van dit proefschrift toonden we aan dat gemuteerde IL7-signalering geremd kan worden met JAK-remmers, ongeacht welke component van de signaleringsroute een mutatie heeft, inclusief IL7Ra en STAT5B. De mate van gevoeligheid voor diverse JAK-remmers (met verschillende activiteit tegen JAK1, JAK2 en JAK3) hangt echter af van het type mutatie. Bovendien trad er synergistische activiteit op voor JAK-remmers in combinatie met MAPK- of BCL2-remmers in Ba/F3-cellen getransformeerd door IL7Ra- of STAT5B-mutaties. Daarnaast hebben we aangetoond dat activerende mutaties in JAK3 veranderingen in fosforylering, en bijgevolg veranderingen in activiteit, induceren in biologische processen waarvan voorheen onbekend was dat ze beïnvloed werden door JAK3-activiteit, waaronder mRNA verwerking/splicing, chromatine remodellering en modificatie van histonen. Om de componenten in deze pathways te identificeren die essentieel zijn voor overleving van IL7-gedreven T-ALL, voerden we 2 CRISPR/Cas9-screens uit in Ba/F3 cellen getransformeerd tot cytokine-onafhankelijke groei door JAK3 M511I, JAK3 L857Q of STAT5B N642H en NRAS G12D als controle. We hebben eerst het geheel van bekende kinasen in de muis gescreend, gevolgd door een zelf ontworpen screen, voornamelijk gericht op epigenetische modificatie en RNA-verwerking. Interessant genoeg identificeerden we Hdac1 en Hdac3 als belangrijke genen voor de proliferatie van JAK3- en STAT5B-getransformeerde cellen, wat wijst op een centrale rol in ons IL7-gedreven celmodel. Behandeling met HDAC-remmers inhibeerde effectief de celoverleving, met een hoge gevoeligheid voor HDAC-remmers van de JAK-STAT-getransformeerde cellen. Andere interessante doelwitten zijn Kdm1a en Cdc7, specifiek voor de JAK3-getransformeerde cellen en Kmt2a en Phf6 voor de STAT5B-getransformeerde cellen. Deze resultaten moeten nog worden gevalideerd en het mechanisme achter de JAK-STAT afhankelijkheid voor deze factoren werd nog niet onderzocht. Om het cohort van T-ALL patiënten te verbreden dat voordeel kan ondervinden van behandeling met gerichte inhibitoren, hebben we ons gericht op de NOTCH1-signaalweg. Meer dan 70% van de patiënten heeft activerende mutaties in NOTCH1-signalering. Ook in gemuteerde toestand moet de transmembraanreceptor NOTCH1 door het gamma-secretase complex geknipt worden om de signaaltransductie te activeren. Eerder werd aangetoond dat remming van NOTCH1 door gamma-secretase remmers de leukemieproliferatie beperkt bij T-ALL patiënten, echter ten koste van gastro-intestinale bijwerkingen. T-ALL cellen brengen meer PSEN1-bevattende gamma-secretase complexen tot expressie dan gezonde cellen. Als gevolg daarvan pakt de PSEN1-selectieve gamma-secretaseremmer MRK-560 T-ALL-cellen effectief aan, zonder dosisbeperkende toxiciteit in vivo in xenograft muismodellen afgeleid van patiënten. We toonden aan dat we PSEN1-selectieve gammasecretaseremmers veilig kunnen combineren met andere inhibitoren gericht tegen signaaltransductie via JAK1/3 en ABL1, of inhibitoren van nucleaire export. Deze combinatiebehandelingen verminderden in vivo de ziektelast en verlengden de overleving. Kortom, in dit werk identificeerden we mogelijke nieuwe doelwitten voor de behandeling van IL7-gedreven T-ALL en ontwikkelden we synergistische combinatiebehandelingen voor IL7- en NOTCH1-gedreven T-ALL op basis van gerichte inhibitoren. Onze behandelingen remden effectief de proliferatie van T-ALL in vivo in xenograft-muismodellen van patiënten en werden goed verdragen. Op deze manier leverden we preklinisch bewijs dat T-ALL-patiënten baat kunnen hebben bij de klinische introductie van deze behandelingsprincipes en bij de verdere farmacologische ontwikkeling van PSEN1-selectieve gammasecretaseremmers." "De coöperatie tussen TLX3 overexpressie en WT1 inactivatie in T-cel acute lymfatische leukemie." "Jan Cools" "Laboratorium voor Moleculaire Biologie van Leukemie (VIB-KU Leuven)" "T-cel acute lymfatische leukemie (T-ALL) is een agressieve hematologische leukemie die veroorzaakt wordt door de stapsgewijze accumulatie van chromosomale afwijkingen en mutaties. De deregulatie van transcriptionele controle en verstoring van epigenetische homeostase zijn kenmerkend voor deze maligniteit. PRC2 is het epigenetisch complex verantwoordelijk voor het schrijven van H3K27me3, de histonmerker geassocieerd met genrepressie en het behoud van celidentiteit. Tot 25% van T-ALL patiënten draagt inactiverende mutaties in SUZ12, EZH2 en EED, de 3 kerncomponenten van het PRC2 complex. Een gerichte sequenering van 155 T-ALL patiënten uitgevoerd in ons laboratorium, heeft aangetoond dat PRC2 mutaties, en SUZ12 mutaties in het bijzonder, frequenter samen voorkomen met mutaties in de IL7R-JAK-STAT signaaltransductie pathway dan verwacht op basis van toeval.Om na te gaan of PRC2 inactivatie coöpereert met mutante JAK3 signaaltransductie tijdens de ontwikkeling van T-ALL, hebben we de JAK3(M511I) mutant tot expressie gebracht in muisbeenmergcellen in vivo en het effect getest van Cas9-gemedieerde inactivatie van Suz12 op leukemie ontwikkeling. Hematopoietische stam- en progenitorcellen (HSPCen) afkomstig van transgene muizen die constitutief Cas9 tot expressie brengen, werden gecotransduceerd met een een retrovirale Suz12 gRNA vector met RFP reporter en een JAK3(M511I) vector met GFP reporter. Na injectie van de getransduceerde cellen in recipiënte muizen, werden deze dieren gevolgd door middel van seriële bloedafnamen.De muizen ontwikkelden een T-cel leukemie die alle hematologische organen infiltreerden. Initieel was de dominante (pre-)leukemische populatie in het bloed was GFP-only (JAK3 M511I)-positief, maar over de tijd werd er een snelle expansie van GFP/RFP dubbel-positieve cellen geobserveerd. Wanneer de muizen opgeofferd moesten worden, was de meerderheid van cellen in het bloed en organen GFP/RFP positief. Verrassend genoeg ontwikkelden muizen geïnjecteerd met Suz12 gRNA-only cellen ook leukemie, dit was echter wel met een langere latentie van 112 dagen vergeleken met 71 dagen bij de JAK3(M511I) + Suz12 gRNA muizen. Deze data zijn een sterke indicatie dat Suz12 inactivatie collaboreert met JAK3(M511I) tijdens T-ALL ontwikkeling.Momenteel wordt het mechanisme van coöperatie nog onderzocht. Differentiële genexpressie analyse heeft aangetoond dat de meerderheid van genen up-gereguleerd worden na Suz12 inactivatie. Zo zijn er 2300 (96%) genen up-gereguleerd in tegenstelling tot slechts 107 (4%) down-gereguleerde genen wanneer we JAK3(M511I) + Suz12 gRNA- vergelijken met JAK3(M511I)-only leukemie. In Suz12 gRNA-only leukemie versus wildtype thymocyten, 1510 (75%) genen waren up-gereguleerd en 514 (25%) genen waren down-gereguleerd. ChIP-seq analyse heeft onthuld dat genoomwijde H3K27me3 niveaus drastisch gereduceerd waren na Suz12 inactivatie, dit is in overeenstemming met intranucleaire FACS kleuring voor deze histonmerker. Daarnaast hebben we ook individuele loci bekeken die voldeden aan de volgende criteria: gereduceerde binding van Suz12, gereduceerde H3K27me3 niveaus en een toename van hoeveelheid promotermerker (H3K4me3). Onder loci die voldeden aan deze 3 criteria vonden we Hoxa genen (Hoxa1, Hoxa3, Hoxa5) en Notch1 target genen (Hes1, Hes2, Hes7, Hey2, Heyl, Dtx1, Dtx4), deze Notch1 pathway genen zijn van groot belang in T-cel ontwikkeling en in T-ALL.Deze data tonen aan dat Suz12 inactivatie coöpereert met JAK3-activerende mutaties in de ontwikkeling van T-ALL in vivo. Daarnaast demonstreert het de toepassingsmogelijkheden van transgene Cas9 muizen in de studie van de rol van tumor suppressor genen in T-ALL muismodellen." "Identificatie en karakterisatie van de kankerstamcel in multipel myeloom." "Karin Vanderkerken" "Immunologie en Microbiologie" "De hypothese van het kankerstamcelmodel is dat niet alle tumorcellen, maar enkel een kleine subpopulatie van de tumorcellen, de kankerstamcel, in staat is om nieuwe tumoren te vormen. Alternatieve termen voor de kankerstamcel is de tumor-initiërende of tumorigene cel. Belangrijke eigenschappen van de kankerstamcel is dat deze zich kan vernieuwen en alle heterogene celtypes van de tumor kan vormen. Het kankerstamcelmodel heeft grote implicaties voor therapie. Er wordt gesuggereerd dat de conventionele therapieën de grote massa van de tumor elimineren, maar niet de kankerstamcel en dit zal dan uiteindelijk leiden tot het terug uitgroeien van de tumor en herval van de patiënt (1). Het eerste bewijs van kankerstamcellen werd aangetoond in de hematologische kanker acute myeloïde leukemie. Er werd aangetoond dat enkel de subpopulatie die de oppervlaktemerker CD34 uitdrukken, maar niet CD38 in staat is om in NOD/SCID muizen tumor te initiëren (2). Ook in solide tumoren, zoals kanker van borst en hersenen, werden kankerstamcellen geïdentificeerd (3, 4). Multipel myeloom (MM) is een hematologische kanker gekarakteriseerd door de accumulatie van kwaadaardige plasmacellen in het beenmerg, die monoklonale antilichamen produceren. De interactie van de beenmerg micro-omgeving met de tumorcellen stimuleert de productie van groeifactoren, angiogene en osteoclast-activerende factoren, resulterend in tumorgroei, angiogenese of de aanmaak van nieuwe bloedvaten en osteolyse leidend tot botziekte (5). De massa van de tumor in het beenmerg bestaat uit gedifferentieerde plasmacellen met als oppervlaktemerker CD138. Er zijn suggesties dat er een B-celpopulatie aanwezig is in het beenmerg en bloed van MM patiënten met dezelfde immuunglobuline gensequentie als de MM plasmacel (6, 7, 8). De rol van deze B-cellen in de pathogenese van MM is onduidelijk, maar recent werd aangetoond dat er een CD138 negatieve subpopulatie aanwezig is in het beenmerg die, in tegenstelling tot de CD138+ tumorcellen, clonogeen en tumorigeen is, in vitro in de clonogene assay en in vivo in NOD/SCID muizen. Deze CD138- cellen drukken de oppervlaktemerkers CD19 en CD20 uit, opnieuw suggererend dat de MM stamcel (MMSC) een B-cel is (9). Het doel van het huidige project is de identificatie en karakterisatie van de MMSC in 5TMM modellen. Deze modellen zijn origineel ontstaan door de spontane ontwikkeling van MM in oude C57BL/KaLwRij muizen met een incidentie van 0.5% (10). MM werd verdergezet door intraveneuze injectie van de beenmergcellen van de zieke muizen in jonge, immuuncompetente en syngene muizen. Op deze wijze ontstonden er verschillende modellen die verscheidene varianten van de ziekte vertegenwoordigen. In ons labo zijn er 2 5TMM modellen aanwezig: het 5T2MM en 5T33MM model. Het 5T2MM model wordt gekarakteriseerd door een langzame groei van de tumor in het beenmerg en de botten vertonen kenmerken van MM botziekte (osteolytische lesies, verminderd trabeculair volume, verhoogde aanwezigheid van osteoclasten). Het 5T33MM model wordt gekarakteriseerd door een snelle groei van de tumor in het beenmerg, maar de muizen vertonen geen MM botziekte (11). In beide modellen werd angiogenese aangetoond in het beenmerg (12). Er werden monoclonale antilichamen gegenereerd die het specifiek idiotype van de 5T2MM en 5T33MM cellen herkennen (13). Het eerste deel van het project bestaat uit de identificatie van de MMSC in de 5TMM modellen waarbij 2 strategieën zullen worden gevolgd. Enerzijds zal de CD138- populatie worden onderzocht volgens de data van Matsui et al. (9) met als meerwaarde het 5TMM model dat syngeen en immuuncompetent is ten opzichte van NOD/SCID muizen. In het 5T2MM model werd reeds beschreven dat er een CD138- populatie aanwezig is en uit preliminaire experimenten blijkt dat ook in het 5T33MM model CD138- tumorcellen aanwezig zijn (14). Een 2de strategie die zal worden gevolgd is in samenwerking met de internationale partners van het MSCNET project (zie ""Situering onderzoek""). Verschillende groepen trachten simultaan de MMSC populatie te identificeren en isoleren vertrekkende van humane stalen op basis van oppervlaktemerkers (multiparametrische flow cytometrie) en met moleculaire technieken. Vervolgens zal op basis van deze resultaten worden onderzocht of er een gelijkaardige MMSC aanwezig is in de 5TMM modellen die kan worden gesorteerd gebruik makend van MACS (magnetic activated cell sorting) en/of FACS (fluorescent activated cell sorting). Voor de celpopulaties verkregen met beide strategieën zal de clonogene capaciteit (in vitro clonogene assay) van de geïsoleerde MMSC worden nagegaan en vervolgens zal de populatie worden ingespoten in jonge syngene muizen om de tumorigene capaciteit te onderzoeken. De ontwikkeling en karakteristieken van MM ziekte zal worden geanalyseerd door het bepalen van de plasmocytose in het beenmerg (cytospins gekleurd met May-Grünwald-Giemsa), de aanwezigheid van paraproteïne in het serum (electroforese), angiogenese (CD31 immunokleuring op beenmergcoupes, in samenwerking met Dr. De Raeve, Pathologie, UZ Brussel) en botziekte (osteolytische lesies, botdensiteit, trabeculair volume en aantal TRAP positieve osteoclasten, in samenwerking met Dr. Croucher, University Sheffield, UK). Een belangrijk kenmerk van de kankerstamcel is dat deze populatie in staat is om alle heterogene celtypes van de tumor te vormen. Het fenotype van de tumorcellen in het beenmerg van muizen ingespoten met de MMSC zal worden nagegaan met flow cytometrie en vergeleken met tumorcellen van muizen ingespoten met de totale, niet gesorteerde populatie. Er is nog niet veel geweten over de MMSC, dus een betere karakterisatie is nodig om de kennis van de pathofysiologie van MM uit te breiden en om nieuwe therapeutische doelwitten te kunnen identificeren. Een uitgebreide karakterisatie zal worden gedaan door het genexpressieprofiel van de MMSC te bepalen en vergelijken met de niet-MMSC (Affymetrix, genoom overspannende mouse gene1.0 array, in samenwerking met Prof. Schuit, KUL). Niet enkel de genetische karakterisatie is belangrijk, maar ook de proteïnen die betrokken zijn in signaalwegen voor de proliferatie en overleving van MM cellen, kunnen veel informatie geven. Er bestaat een array die de fosforylatie van een groot aantal verschillende kinase substraten kan detecteren (PepChips). Het kinoom van de MMSC zal worden vergeleken met de niet-MMSC. Dit is een onderdeel van het MSCNET programma en deze experimenten zullen in samenwerking worden uitgevoerd met Dr. Bos (University Medical Center, Groningen, Nederland). In MM zijn de tumorcellen gelokaliseerd in het beenmerg is en dat is deels te wijten aan een specifieke homing van de tumorcellen naar het beenmerg waar ze dan de juiste niche vinden om te groeien. De homingscapaciteiten van de MMSC naar het beenmerg en de lokalisatie van deze cellen in het beenmerg zullen worden geanalyseerd. De homing wordt gekwantificeerd door radioactief gemerkte MM cellen in te spuiten en na 18 uur de recovery in het beenmerg te meten (15). Voor de lokalisatie van de stamcel tov. de verschillende celtypes in de beenmerg micro-omgeving zijn er verschillende opties om de tumorcellen te detecteren. Er kan worden gebruik gemaakt van de anti-idiotype antilichamen (op voorwaarde dat het idiotype wordt uitgedrukt door de MMSC), de tumorcellen kunnen worden gemerkt met een fluorescente probe vooraleer in te spuiten of de cellen kunnen worden getransduceerd met een lentivirale vector die green fluorescent protein (GFP) bevat (gevolgd door detectie met ofwel fluorescentie of confocale microscopie ofwel immunokleuring tegen GFP en evaluatie met lichtmicroscopie). Een belangrijk kenmerk van de kankerstamcel is resistentie tegen de gebruikte geneesmiddelen dat te wijten zou kunnen zijn aan de expressie van ABC transporters en het ""quiescent"" zijn van de stamcel (16). Ook in MM werd aangetoond dat de CD138- MMSC populatie resistent is tegen klinisch actieve stoffen (17). De proliferatie en celcylcus eigenschappen en de expressie van ABC transporters van de MMSC zullen worden nagegaan en vergeleken met de niet-stamcel populatie. Met 3H-thymidine incorporatie assays zal worden nagegaan wat het effect is van de klinisch meest relevante drugs (melphalan, dexamethasone, thalidomide, bortezomib) op de DNA synthese van de MMSC en de niet-MMSC. Vorig onderzoek in ons labo toonde aan dat de behandeling van 5TMM zieke muizen met de IGF-1receptor inhibitor, picropodophyllin (PPP) resulteerde in een drastische vermindering van tumorload, angiogenese en botlesies en een verlenging van overleving (18, 19). Bovendien zijn er ook ongepubliceerde data van onze groep die aantonen dat de bulk van 5TMM cellen gevoelig zijn aan methylatie (5'aza-2'-deoxycytidine) en HDAC (LBH589) inhibitoren. De effecten van deze producten op de MMSC zullen worden nagegaan. In MM werd aangetoond dat de beenmerg micro-omgeving zowel adhesiemoleculen uitdrukt als humorale factoren secreteert welke de overleving en groei van MM cellen bevordert. Een aantal groeifactoren werden beschreven met als belangrijkste interleukine-6 (IL-6) en insulin-like growth factor-1 (IGF-1). De MM cellen drukken receptoren uit voor deze groeifactoren (20, 21). We willen nagaan of de beenmerg stromale cellen enerzijds en deze groeifactoren (IL-6 en IGF-1) anderzijds ook belangrijk zijn voor de MMSC. Hiervoor gaan we de expressie van deze receptoren meten met flow cytometrie op de MMSC en niet-MMSC en het effect van de stromale cellen en van IL-6 en IGF-1 op de proliferatie van de 2 celpopulaties bepalen. Signaaltransductiewegen zoals Notch en hedgehog reguleren zelfvernieuwing en zouden belangrijk zijn in normale stamcellen en kankerstamcellen (1). Peacock et al. (22) heeft beschreven dat de hedgehog pathway betrokken is in het onderhouden van de CD138- MMSC populatie. We zullen deze bevindingen trachten te bevestigen in ons systeem. Er is niets geweten over de Notch pathway. In ons labo is er al enige expertise in de Notch pathway en met real-time PCR zal de expressie van Notchreceptoren (Notch1, 2, 3, 4), liganden (dll1, 3, 4, jagged-1, -2) en doelwitgenen (Hes1, 5, HeyL, Hey1, 2) worden bepaald in de MMSC en niet-MMSC. Afhankelijk van de resultaten zullen we op eiwitniveau bevestigen door western blotting." "Het verband tussen hypoxie en progenitor cellen bij carcinogenese in de lever" "De evolutie van een primaire levertumor naar een hepatocellulair carcinoma of een cholangiocarcinoma lijkt te gebeuren over een progenitor lever cel. Deze progenitor cel zal afhankelijk van de aanwezige pathways (waar o.a. Notch pathway) en in de aan- of afwezigheid van hypoxie deze progenitor cel zich dedifferentieren naar een cel met meer hepatocytaire of galwegkenmerken. Deze pathways en evoluties zullen in dit project geëvalueerd worden." "De rol van BMP signalering in vroeger arteriële differentiatie." "Elizabeth Jones" "Centrum voor Moleculaire en Vasculaire Biologie" "Het hart- en bloedvatensysteem ontwikkelt zich als eerste orgaan systeem tijdens de vroege embryonale ontwikkeling en voorziet het embryo van de nodige zuurstof en nutriënten. Al zeer vroeg tijdens hun ontwikkeling worden bloedvaten gekarakteriseerd als een arterie of vene. De correcte differentiatie van arteriën en venen, ook wel arterioveneuze differentiatie genoemd, is een cruciale stap tijdens de ontwikkeling van het embryo. Een verstoorde arterioveneuze differentiatie kan arterioveneuze malformaties (AVMs) veroorzaken, waarbij een directe verbinding wordt gemaakt tussen een arterie en een vene, zonder eerst doorheen de capillairen te lopen. Als een gevolg hiervan worden venen bloot gesteld aan de hoge arteriële druk, waar ze niet voor uitgerust zijn, en AVMs zijn dan ook gevoelig aan scheuren. Vele patiënten beseffen niet dat ze AVMs hebben, maar wanneer een AVM in een van de grote organen, zoals hart, longen of hersenen scheurt, is dit levensbedreigend voor de patiënt.Tijdens de vroege embryonale ontwikkeling van muizen wordt de arteriële specificatie van endotheelcellen geïnduceerd vanaf dat het embryo 4 somieten heeft. Deze vroege arteriële specificatie wordt gekenmerkt door de expressie van Dll4, Cx37 en Hey1, allen genen geassocieerd met de Notch signaleringsweg, in de gepaarde dorsale aortae van het embryo. Tijdens dit vroege stadium van de ontwikkeling is er echter nog geen Notch-receptor expressie aanwezig in de dorsale aortae, welke onder normale omstandigheden de expressie van Dll4, Cx37 en Hey1 drijft. Een Notch onafhankelijke pathway moet dus verantwoordelijk zijn voor de vroegste arteriële specificatie van endotheelcellen die wordt geobserveerd in muis embryo's. De Notch signaleringspathway werkt nauw samen met verscheidene andere pathways, zo ook met de SMAD1/5/9 signaleringspathway. In dit project onderzoeken we de rol van SMAD1/5/9 in arteriële differentiatie en zijn samenwerking met de Notch signaleringspathway." "Karakterisatie van moleculaire pathways die humane T cel ontwikkeling sturen" "Tom Taghon" "Vakgroep Klinische Biologie, Microbiologie en Immunologie" "T cellen spelen een essentiële rol in het immuunsysteem voor de verwijdering van pathogene organismen en tumor cellen. De ontwikkeling van T cellen wordt gestuurd door Notch signalisatie. In dit project wensen we het precieze werkingsmechanisme van Notch tijdens T cel ontwikkeling te ontrafelen, alsook de interactie van de deze pathway met ander signalisatiecascades die cruciaal in dit ontwikkelingsproces."