Titel Promotor Affiliaties "Korte inhoud" "iPSC gebaseerde parenchymale en sinusoidale lever cel-mimics voor DILI en NAFLD studies (iPSC-LiMic)" "Catherine Verfaillie" "Stamcel- en Ontwikkelingsbiologie, Vrije Universiteit Brussel, Universiteit Gent" "In iPSC-LiMic gaan we een uniek platform opzetten in Vlaanderen, en een van de weinige platformen in Europa, waarin we iPSC-afgeleide hepatocyten en hepatische stellaat cellen (HSC), sinusoïdale endotheelcellen van de lever (LSEC) en Kupffer-cellen (KC) van menselijke iPSC zullen creëren, die worden geassembleerd in 3D-coculturen (3D iPS-lever mimics), die gedurende >20 dagen in cultuur kunnen worden gehouden. Deze 3D iPS-lever mimics worden geminiaturiseerd en gerobotiseerd, en intern gevalideerd voor hun geschiktheid om DILI en NAFLD te evalueren, alsook anti-NAFLD-medicijnen te testen. Dit is van aanzienlijk belang voor de farmaceutische en biotechnologiesector, inclusief verschillende leden van de IAB. De unieke voordelen van de iPS-lever mimics zijn, dat ze niet onderhevig zijn aan inter-donor en inter batch variabiliteit, wat onvermijdelijk is bij primaire levercellen, en ze bestaan uit iPSC die uitgerust kunnen worden met fluorofoorcassettes, waardoor beeldvorming mogelijk is van tijdafhankelijke, celspecifieke en stresspad-specifieke effecten van geneesmiddelen en metabole veranderingen op de 3D iPS-lever mimics. Bovendien zal het, via scRNAseq en CITE-Seq van normale en NAFLD-levercellen mogelijk zijn om a) individuele ontwikkelingsroutes voor verschillende levercelfenotypen te identificeren; b) celspecifieke antilichamen om gezonde versus NAFLD zieke hepatocyten, LSECs, HSCs en KCs beter te karakteriseren; c) receptor-ligandparen die anders tot expressie worden gebracht in NAFLD versus gezonde lever; en d) specifieke stresspadgenen die worden geactiveerd in NAFLD. Die laatste kandidaat therapeutische targets kunnen dan gevalideerd worden via samenwerkingen met geïnteresseerde IAB of andere bedrijven tijdens de looptijd van de subsidie of als vervolgprojecten. Ten slotte zal gedurende de looptijd van de subsidie continue verdere technologieontwikkeling gebeuren in het iPSC-LiMic consortium, mede door discussies met technologie-gedreven bedrijven in de IAB. " "SBO Project : iPSC gebaseerde parenchymale en sinusoidale lever cel-mimics voor DILI en NAFLD studies (iPSC-LiMic)" "Leo A van Grunsven" "Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek, Ghent University, KU Leuven, Laboratorium Levercelbiologie, Translationele Levercelbiology, Basis (bio)-medische wetenschappen" "In iPSC-LiMic gaan we een uniek platform opzetten in Vlaanderen, en een van de weinige platformen in Europa, waarin we iPSC-afgeleide hepatocyten en hepatische stellaat cellen (HSC), sinusoïdale endotheelcellen van de lever (LSEC) en Kupffer-cellen (KC) van menselijke iPSC zullen creëren, die worden geassembleerd in 3Dcoculturen (3D iPS-lever mimics), die gedurende >20 dagen in cultuur kunnen worden gehouden." "Op iPSC gebaseerde parenchymale en sinusoïdale levercel-nabootsingen voor DILI- en NAFLD-onderzoeken (iPSC-LiMic)" "Martin Guilliams, Yvan Saeys, Charlotte Scott" "Vakgroep Toegepaste Wiskunde, Informatica en Statistiek, Vakgroep Biomedische Moleculaire Biologie" "geen abstract" "Ontwikkeling van een spin-offbedrijf voor geneesmiddelenonderzoek op basis van 2D & 3D menselijke iPS cel-afgeleide levercelmodellen NAH & (i) +DILI." "Catherine Verfaillie" "Stamcel- en Ontwikkelingsbiologie" "Het doel van dit voorstel is om een spin-off te creëren die zich richt op het aanleveren van gemiddelde tot hoge doorvoer screenings modellen bestaande uit 2D- en 3D-celkweeksystemen voor leverziekten zoals DILI en NASH. De huidige in vitro celmodellen kunnen het complexe gedrag van levercellen niet reproduceren zoals toxiciteit door medicamenteuze behandelingen of modelleren complexe leverziekten. Dit vormt een belangrijke hindernis voor farmaceutische en biotechbedrijven, en leidt tot het vroegtijdig beëindigen van klinische proeven en schaarste aan nieuwe geneesmiddelen op de markt. Het unieke verkoopargument van ons voorstel is het vermogen om geneesmiddeltoxiciteit nauwkeuriger te voorspellen dan de commercieel beschikbare modellen en om nauwkeurige modellering van cel-celinteracties tijdens ontsteking, steatose en fibrogene reacties mogelijk te maken. Door de robuuste genomisch ontworpen celmodellen, die door onze groep zijn gemaakt, te combineren met een speciaal gebouwd automatiseringsplatform, al geïnstalleerd en gevalideerd in het Stem Cell Institute, kunnen we functionele, complexe, 2D- en 3D-celmodellen creëren op basis van hiPSC-afgeleide rijpe levercellen. Hierdoor kan het probleem van de beschikbaarheid en variabiliteit van primaire levercellen die het creëren van robuuste en consistente leverziektemodellen belemmeren, worden omzeild." "De rol van pili op Lactobacillus rhamnosus GG in de interactie met macrofagen en andere immuuncellen" "Jos Vanderleyden" "Aangeboren Afwijkingen in Immunologie, Afdeling: Centrum voor Microbiële en Plantengenetica" "Het menselijk lichaam wordt gekoloniseerd door een groot aantal bacteriën, collectief aangeduid als de intestinale microbiota. De microbiota vormen een complex bilateraal systeem met gastheercellen, zoals epitheelcellen en cellen van het immuunsysteem. Functies die bijdragen tot de vertering van voedsel, afweer tegen pathogenen, versterken van de werking van de epitheliale barrière en modulatie van het immuunsysteem worden toegeschreven aan deze bacteriën. Het aantonen van deze gunstige functies heeft geleid tot het isoleren van bacteriële stammen die gebruikt worden als probiotica. Probiotica worden gedefinieerd als “levende microorganismen die, wanneer ze in voldoende hoeveelheid worden toegediend, een gezondheidsbevorderend effect voor de mens opleveren. In de voorbije decennia is er een opvallende stijging van allergieën in de geïndustrialiseerde wereld waargenomen. Dit is waarschijnlijk veroorzaakt door een verminderd contact van de mens met micro-organismen en parasieten. Dit contact is belangrijk om ons immuunsysteem te trainen. Het mogelijk gebruik van probiotica in het voorkomen en/of behandelen van atopische aandoeningen heeft bijgevolg heel wat interesse gewekt. Lactobacillus rhamnosus GG is één van de best klinisch gedocumenteerde probiotische stammen. De reeds gedocumenteerde gezondheidsbevorderende effecten betreffen ondermeer het versterken van ons immunologisch afweersysteem en het verminderen van de ontwikkeling van atopische aandoeningen. Nochtans zijn niet alle gezondheidsbevorderende effecten van L. rhamnosus GG even goed gedocumenteerd. Gezondheidsorganisaties zijn vragende partij om verder diepgaand onderzoek in deze sector uit te voeren. Recent werd beschreven dat de probiotische stam L. rhamnosus GG aan het celoppervlak talrijke pili draagt. Pili zijn opgebouwd uit proteïnen. Er is sterk bewijs dat deze pili belangrijke strukturen zijn voor de aanhechting van deze bacteriën aan epitheelcellen en de mucuslaag. Deze bacteriën zijn zelfs in staat om een anti-ontsekingsreactie op te wekken. In dit doctoraat beoogden we de interactie en de mogelijke immunomodulerende functie van de SpaCBA pili van L. rhamnosus GG te achterhalen in immuuncellen. In een eerste stap opteerden we voor een eenvoudig modelsysteem met muizen macrofaagcellijnen (Raw264.7) en humane monocyt cellijnen (THP-1). Door gebruik te maken van een aantal isogene mutanten van L. rhamnosus GG, konden we aantonen dat de SpaCBA pili van L. rhamnosus GG van groot belang zijn voor de adhesiecapaciteit aan macrofagen en dat hun interactie de opname van de bacteriën stimuleert, wat ten dele gemedieerd wordt door CR3. Voor EPS moleculen daarentegen werd aangetoond dat ze de phagocytose inhiberen. Bovendien suggereren onze bevindingen dat de SpaCBA pili een anti-ontstekingseffect mediëren via de inductie van IL-10 mRNA. De Lactobacilli pili induceren niet rechtstreeks de expressie van IL-10, aangezien gelijkaardige concentraties van IL-10 mRNA werden waargenomen na contact met de wild-type stam. Waarschijnlijk is de blootstelling van SpaCBA pili en/of andere structuren in de mutant die de galactose-rijke EPS laag niet bevatten verantwoordelijk voor de verhoogde productie van IL-10. Bovendien blijken de SpaCBA pili te werken als negatieve modulator van IL-6 mRNA expressie in macrofagen. Bovendien werd ook de beschermende functie van EPS aangetoond, door het afschermen en het onrechtstreeks verminderen van de immunostimulerende functie van andere bacteriële moleculen in macrofagen.Vervolgens hebben we getracht het immunomodulerend vermogen van de SpaCBA pili van L. rhamnosus GG in een meer complex celsysteem in te schatten; met name door gebruik te maken van primaire humane PBMCs, afkomstig van donoren met verschillende achtergrond en allergie-fenotypes. Hierbij bleek dat de pili, zij het rechtstreeks of onrechtstreeks, betrokken zijn bij de inductie van IL-10 mRNA en de inhibitie van IL-6 expressie in PBMCs van gezonde donoren. Dit wijst eveneens op het anti-ontstekingseffect van de L. rhamnosus GG pili. De galactoserijke EPS moleculen daarentegen blijken een immunostimulerende rol te hebben. Vervolgens hebben we de cytokine profielen van PBMCs van allergische en gezonde personen, na blootstelling aan L. rhamnosus GG cellen, opgevolgd. Onze resultaten suggereren dat de PBMCs van allergische personen minder reageren dan de cellen van de controlepersonen. Dit kan belangrijke gevolgen hebben voor het succes van probiotische behandeling van allergische patiënten aangezien deze minder reageren in vergelijking met gezonde personen.In het laatste gedeelte van dit doctoraat hebben we gebruik gemaakt van een muizen APC/T celcultuur met de bedoeling te onderzoeken of SpaCBA pili een impact kunnen hebben op T-cel polarisatie, aangezien differentiatie van specifieke subsets van T-cellen (i.e.Th2) en het slecht functioneren van Tregs te maken hebben met allergie. Door de Tcel polarisatie te bestuderen, hebben we bijkomende gegevens over de differentiatie van specifieke T cellen na stimulatie van APCs die voorafgaandelijk werden blootgesteld met verschillende L rhamnosus GG cellen. Alhoewel de niveaus van IFN-γ, IL-4, IL-17, IL-10 en expressie van Foxp3 in deze T-cellen laag was, wijzen onze resultaten er toch op dat de galactoserijke EPS moleculen van L. rhamnosus GG betrokken kunnen zijn in de differentiatie van Th1 en Foxp3+ Tregs. Jammer genoeg kon geen specifieke rol van de pili in T-cell polarisatie worden aangetoond.Samengevat hebben in deze doctoraatsstudie kunnen aantonen dat naast de SpaCBA pili , ook de galactoserijke EPS moleculen van L. rhamnosus GG van groot belang zijn in hun immunomodulerende interacties met immuuncellen. Evenwel zijn er waarschijnlijk verschillende indirecte effecten betrokken. Dit is onderwerp voor verder onderzoek. De juiste functie van pili en EPS moleculen blijkt in sterke mate afhankelijk te zijn van het celtype en de genetische achtergrond van de gastheer. Ook de wijze waarop deze grote oppervlakte moleculen aan het celoppervlak blootgesteld worden is belangrijk.Onze studie geeft eveneens stof voor verder onderzoek gericht op het gebruik van L. rhamnosus GG in de behandeling van allergische aandoeningen, in zoverre dat het gebruik van L. rhamnosus GG in de behandeling van allergische aandoeningen, in de zin dat er aanduidingen werden gevonden dat immuuncellen van mensen met allergieën in mindere mate reageren op L. rhamnosus GG in vergelijking met gezonde individuen.In vergelijking met wild-type induceert de isogene mutant die deficiënt is in de productie van EPS lagere concentraties pro inflammatoire cytokines zoals TNF en IL-6 in PBMCs van allergene patienten en dit wijst op mogelijk therapeutisch gebruik voor dergelijke behandeling." "Morfo-syntactische variatie in de Griekse documentaire papyri (III v. Chr. - VI n. Chr.). Een socio-historische onderzoek" "Mark Janse" "Vakgroep Taalkunde" "Dit onderzoek bestudeert de relatie die bestaat tussen bepaalde taalkundige (morfo-syntactische) en sociale eigenschappen, en hoe die relatie evolueert doorheen de tijd. Het corpus bestaat uit Griekse ‘documentaire’ papyri, met een klemtoon op drie algemene teksttypes, met name ‘brieven’, ‘contracten’ en ‘verzoekschriften’. Vanuit theoretisch perspectief grijpt het onderzoek terug naar het ‘Systemisch Functionele’ kader." "Geneesmiddel-geïnduceerde cholestase: Een mechanistische exploratie van de hepatische galzout dispositie" "Pieter Annaert" "Farmacotechnologie en Biofarmacie" "Geneesmiddel-geïnduceerde levertoxiciteit (Drug-induced liver injury, DILI) is de meest voorkomende reden voor het van de markt halen van geneesmiddelen (Xu et al., 2004; Atienzar et al., 2016). Het vormt als dusdanig een groot risico voor de gezondheid van de patiënt, maar ook voor de farmaceutische industrie. Gedurende niet-klinische toxiciteitsonderzoeken is er een gebrek aan de identificatie van geneesmiddelen die DILI kunnen veroorzaken, hetgeen ernstige problemen vormt voor de farmaceutische industrie. De huidige niet-klinische in vivo dierproeven kunnen DILI niet betrouwbaar detecteren aangezien verscheidene DILI mechanismen verschillen tussen dieren en mens. Bijgevolg en daarbij ook rekening houdend met het 3R principe (replacement, refinement, reduction), heeft het niet-klinisch toxiciteitsonderzoek als doel de conventionele in vivo dierproeven te vervangen en betrouwbare in vitro methoden te implementeren. Deze in vitro methoden zijn cruciaal voor de nauwkeurige voorspelling en screening van geneesmiddelen die DILI kunnen veroorzaken. Helaas is de zoektocht naar de ontwikkeling van zulke nieuwe modellen of de optimalisatie van de huidige in vitro modellen ook nog steeds belemmerd door de beperkte mechanistische kennis met betrekking tot DILI. Daarom is het cruciaal om ons begrip over de toxiciteitsmechanismen van DILI te vergroten en om als dusdanig onze kennis over DILI te verbeteren.Eén van de belangrijkste vormen die betrekking heeft tot DILI is geneesmiddel-geïnduceerde cholestase (Drug-induced cholestasis, DIC). DIC maakt meer bepaald deel uit van ongeveer de helft van de DILI cases uit. DIC wordt veroorzaakt door een storing in de galzout homeostase, wat resulteert in een pathologische accumulatie van galzouten in de lever die uiteindelijk leverschade teweeg brengen. Daarom is het belangrijk dat de pathways die verantwoordelijk zijn voor het behoud van de galzout homeostase in vivo, worden nagebootst in een in vitro model. Tot nu toe werd de inhibitie van de Bile Salt Export Pump (BSEP) aangenomen het enige mechanisme te zijn met betrekking tot DIC. Aangezien de galzout homeostase een complexe wisselwerking vormt tussen verscheidene andere hepatische transport proteïnes en metaboliserende enzymes, groeit het belang van een meer uitgebreide mechanistische kennis over andere oorzaken van DIC, afgezien van BSEP inhibitie. Bovendien zal een verbeterde kennis over de verschillende aspecten van de galzout homeostase onze perceptie verruimen voor de ontwikkeling van meer geavanceerde in vitro en in silico modellen.Het overkoepelende doel van het huidige proefschrift was gericht op het mechanistisch begrijpen van interferenties in de galzout homeostase, veroorzaakt door geneesmiddelen. Derhalve werden levercellen van rat of humane oorsprong in een sandwich-configuratie (tussen twee lagen collageen; SCRH of SCHH) aangewend als in vitro model om de galzout dispositie in vitro na te bootsen. Dit model bevat alle lever-specifieke functies, samen met het behoud van hepatische transport proteïnes en metabolische enzymes. In dit opzicht werd een door onze onderzoeksgroep eerder ontwikkeld in vitro DIC systeem geoptimaliseerd en gevalideerd met behulp van een bredere set aan (niet)-lever toxische componenten (Doelstelling 1). Dit in vitro DIC systeem is gebaseerd op de incubatie van een cholestatische component met een fysiologisch galzout mengsel, teneinde de vorming van ureum te meten om zo de cel functionaliteit te bepalen. In een volgende fase werd dit in vitro DIC systeem geïmplementeerd om als mechanistisch platform te dienen zodanig de huidige kennis over de rol van andere hepatische transport proteïnes in DIC te verbeteren (Doelstelling 2). Het onderzoek in huidig proefschrift heeft getracht een antwoord te geven op specifieke onderzoeksvragen:Kunnen zowel gecryopreserveerde als vers-geïsoleerde cellen worden gebruik in het in vitro DIC systeem? (Hoofdstuk 3; onderdeel van Doelstelling 1)Kunnen cholestatische verbindingen op betrouwbare wijze voorspeld en vertaald worden naar een risico voor DIC in vivo, gebruikmakende van het in vitro DIC systeem? (Hoofdstuk 4; onderdeel van Doelstelling 1)Welke mechanismen zijn betrokken bij de stimulatie van OATP1B1-gemedieerde opname in hepatocyten en speelt dit mechanisme een rol in de onderbreking van de galzout homeostase, veroorzaakt door een geneesmiddel? (Hoofdstuk 5 en 6; Deel van doelstelling 2)Hoe kan bosetan de galzout dispositie beïnvloeden, zoals weerspiegeld met een prototypisch galzuur, chenodeoxycholzuur (CDCA), in SCHH en welke mechanismen zijn hierbij betrokken? (Hoofdstuk 7, onderdeel van Doelstelling 2)Een eerste studie demonstreerde de uitwisselbaarheid van hepatocyten vóór of na cryopreservatie in het in vitro DIC systeem. Hiervoor hadden we gebruik gemaakt van SCRH, hetgeen een adequate robuustheid bleek te bieden. Tijdens de studie werden SCRH, verkregen uit ofwel vers-geïsoleerde als cryopreserveerde hepatocyten, gebruikt om het cholestatische potentieel van twee gekende cholestatische verbindingen, cyclosporin A en troglitazone te bepalen. Het onderzoek leverde soortgelijke geneesmiddel-geïnduceerde cholestase index waardes (drug-induced cholestasis index; DICI) op, onafhankelijk van de cryopreservatie geschiedenis. Een DICI waarde weerspiegelt de verhouding van ureum dat is geproduceerd onder de omstandigheden waarbij de componenten met een mengsel van galzouten samen geïncubeerd werden en het ureum geproduceerd onder omstandigheden waarin de componenten alleen werden geïncubeerd. Een DICI waarde lager dan 0.80 suggereert dat een component bij een bepaalde concentratie de galzout homeostase in de SCRH kan verstoren. Het was belangrijk dat we tijdens de huidige studie de ureumproductie voor de confluentie van de culturen normaliseerden, aangezien SCRH van cryopreserveerde hepatocyten een lagere confluentie bleken te hebben, in vergelijking met SCRH van vers-geïsoleerde hepatocyten.Om de tweede onderzoeksvraag te beantwoorden, werden 14 (niet)-levertoxische componenten van het EU-EFPIA IMI-project MIP-DILI consortium gebruikt om de prestaties van het in vitro DIC systeem te onderzoeken en aldus een meer uitgebreide validatie van het model uit te voeren. Verscheidene batches van humane hepatocyten in sandwich-cultuur waren gekwalificeerd met betrekking tot hun gevoeligheid voor de analyse van DIC in vitro door cyclosporin A-geïnduceerde veranderingen in de galzout homeostase na te gaan. Om de hoge inter-individuele variabiliteiten tussen donoren te verduidelijken, werden ""Cyclosporin A DICI-positieve"" humane donoren geïntroduceerd om humane donoren uit te sluiten die geen storing in de galzout homeostase veroorzaakten in aanwezigheid van cyclosporin A. De 14 (niet)-levertoxische componenten werden ingedeeld op basis van het veiligheidsmarge (Safety Margin; SM) -concept. Met behulp van de SM, kunnen we het cholestatisch risico van elke component in vivo bepalen. In de huidige studie was het mogelijk om alle 14 (niet)-levertoxische componenten eenduidig te classificeren op hun risico op DIC in vivo, gebaseerd op de SM en in vivo incidentie zoals in de literatuur vermeld stond.De volgende twee studies richtten zich op het mechanistische begrip van de door geneesmiddelen-geïnduceerde verstoringen van de galzout homeostase. Daarom werd de rol van hepatische opname, namelijk het Organische Anion Transporting Polypeptide 1B1 (OATP1B1) in de galzout homeostase dieper bestudeerd. Als hypothese werd gesteld dat domperidone, waarvoor modulatie van OATP1B1-gemedieerd transport in vitro is aangetoond, de opname van galzouten zou kunnen stimuleren en als zodanig de galzout homeostase zou kunnen verstoren. Als eerste, hebben we het modulerende effect van domperidone op OATP1B1-gemedieerde opname van 2 fluorescerende substraten (natriumfluoresceïne en cGamF) onderzocht met behulp van verschillende hepatische in vitro modellen, namelijk OATP1B1-getransfecteerde cellijnen, rat en humane levercellen in suspensie. Daarnaast werd de rol van OATP onderzocht bij de opname van domperidone in hepatocyten van rat en menselijke oorsprong. In het algemeen werd aangetoond dat de stimulerende capaciteit van domperidone substraat- en isoform-afhankelijk was. Daarnaast resulteerde domperidone in een inhibitie van natriumfluoresceine transport in rat hepatocyten. Ten tweede werd het in vitro DIC systeem toegepast om het effect van domperidone op de galzout homeostase te onderzoeken. Opnieuw werd een species-afhankelijk effect waargenomen, waarbij werd aangetoond dat domperidone de galzout homeostase duidelijk in de humane hepatocyten verstoorde, hetgeen niet het geval was in rat hepatocyten. Naast verlaagde DICI waarden door domperidone in humane cellen, was domperidone in staat om de hoeveelheid van de glycine geconjugeerde galzouten te verlagen, terwijl verhogingen werden waargenomen in de hoeveelheid van niet-geconjugeerde galzouten op een concentratieafhankelijke wijze. Daardoor werd er een nieuwe parameter geïntroduceerd, namelijk de bile acid disturbance index (BADI), hetgeen mechanistische informatie bood in welke mate een (cholestatische) component de galzout homeostase kon verstoren in humane cellen. De BADI-waarde is een verhouding van het relatieve verschil in de accumulatie van niet-geconjugeerde galzouten in het cultuur medium en het relatieve verschil in de accumulatie van intracellulaire geconjugeerde galzouten. Zowel domperidone als de positieve controle cyclosporine A waren in staat om BADI op een vergelijkbare manier te verhogen, terwijl afname in DICI waarden voor beide componenten werd waargenomen. Verder werd er geobserveerd dat domperidone de hoeveelheden van endogene galzouten kon verlagen. De studie concludeerde dat domperidone en cyclosporine A in staat waren om de galzout homeostase te wijzigen door mechanismen die nog niet volledig zijn uitgelicht. De modulatie van galzout opname transport in humane hepatocyten zou echter een mogelijk mechanisme kunnen zijn dat deel uitmaakt van DIC. In het algemeen kunnen we stellen dat een betrouwbare meting van endogene en exogeen toegevoegde galzouten in het cultuur medium en cellen een interessant en gevoelig hulpmiddel zijn om veranderingen in de galzout homeostase te onderzoeken. Als conclusie werd er gesteld dat een verstoring in de galzout homeostase, in plaats van een intracellulaire accumulatie van galzouten in het bijzonder, dient als aanvang van DIC.In een laatste studie van het proefschrift, werd er verondersteld dat andere mechanismen dan BSEP-inhibitie mogelijks betrokken zouden zijn bij bosentan-geïnduceerde cholestase. Daarom hebben we de effecten van klinisch relevante concentraties bosentan bestudeerd op de dispositie van endogene galzouten, maar ook werd het effect van bosentan nagegaan wanneer hepatocyten extra gechallenged werden met CDCA. Hierbij hebben we aangetoond dat bosentan in staat was de opname van CDCA te remmen, mogelijks de omzetting van CDCA naar GCDCA te inhiberen en beide sinusoidale en canaliculaire efflux klaringen te beïnvloeden. Bovendien werd inhibitie van galzout synthese door bosentan waargenomen door een verminderde hoeveelheid endogene galzouten in aanwezigheid van bosentan in SCHH. Ten slotte kregen we inzicht in het algemene effect van bosentan op de galzout homeostase in SCHH. In dat opzicht verschaffen deze resultaten een mechanistisch perspectief op de interferentie van bosentan op de galzout dispositie in humane hepatocyten, hetgeen ons zal helpen bij het bekomen van een verbeterd mechanistisch inzicht in bosentan-geïnduceerde cholestase.Samengevat heeft dit onderzoek bijgedragen aan de ontwikkeling en verbetering van nieuwe en momenteel bestaande in vitro methoden voor een betere voorspelling van DIC in vivo. Het in vitro DIC systeem draagt bij tot een betere identificatie van geneesmiddelen of kandidaat-geneesmiddelen die mogelijks DIC in vivo veroorzaken en zodoende ondersteunt het systeem een adequate besluitvorming met betrekking tot het risico van DIC in vivo in te schatten. Daarnaast leverde het inzicht op in de mechanismen die betrokken zijn bij geneesmiddel-geïnduceerde veranderingen in de galzout homeostase door de impact van hepatische opname transport proteïnes in DIC na te gaan. Een verbreking van de galzout homeostase, in plaats van een intracellulaire accumulatie van galzouten is verondersteld aan de basis te liggen van galzout-gemedieerde toxiciteit, hetgeen blijkt uit de gevoelige analyse van galzouten in verschillende compartimenten (medium, cel en gal). Daarom, galzoutmetingen dienen als waardevolle eindpunten om de pathways in de galzout homeostase, die onderbroken worden door een cholestatische verbinding, mechanistisch te bepalen. Hoewel er nog veel fundamentele vragen open blijven, zullen de verkregen resultaten nuttig zijn bij de verdere ontwikkeling van andere, meer geavanceerde in vitro modellen om DIC te voorspellen en benadrukt dit onderzoek het belang om onze kennis te vergroten over de belangrijke pathways die een rol spelen bij DIC." "Geneesmiddel-geïnduceerde cholestase: in vitro detectie en mechanistisch inzicht." "Pieter Annaert" "Farmacotechnologie en Biofarmacie" "Geneesmiddel-geïnduceerde leverschade (drug-induced liver injury, (DILI)) is één van de belangrijkste oorzaken van het stopzetten van klinische studies en/of het terugtrekken van geneesmiddelen, wat tot grote verliezen leidt voor farmaceutische bedrijven. Ondanks de enorme financiële verliezen ten gevolge van DILI, is de impact op de patiëntenzorg van veel groter belang. Zo zijn er in de literatuur tal van gevallen gerapporteerd die de potentieel fatale gevolgen van DILI illustreren. Er is dan ook een grote nood aan gevalideerde preklinische methodes voor de detectie van levertoxische moleculen tijdens de vroege fasen van het geneesmiddelenontwikkelingsproces. De complexiteit van DILI mechanismen bemoeilijkt echter de zoektocht naar deze gevalideerde methodes. Zo manifesteert DILI zich in een aantal predominante vormen waaronder cholestase, acute hepatitis en steatose, waardoor er tal van mechanismen aan de basis kunnen liggen van DILI. Een beter begrip van deze onderliggende mechanismen is dan ook een absolute prioriteit voor de verdere verfijning van preklinische selectiemethodes tijdens het geneesmiddelenonderzoek. Gedurende het laatste decennium werd dan ook veel moeite gedaan om de mechanismen van DILI te achterhalen. Zo blijkt ongeveer de helft van de DILI gevallen symptomen van cholestase te vertonen. Dit maakt van cholestase de belangrijkste oorzaak van DILI. Cholestase is een aandoening waarbij de galsecretie door de lever sterk is afgenomen, onder meer door inhibitie van de in de lever aanwezige transportmechanismen. Dit fenomeen resulteert in een pathologische accumulatie van galzouten, met levertoxiciteit tot gevolg. De vroegtijdige detectie van geneesmiddel-geïnduceerde cholestase (drug-induced cholestasis (DIC)) blijft echter een grote uitdaging tijdens de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen. De meest courante in vitro modellen veronderstellen dat het nagaan van de interactie met één of meerdere hepatische transporteiwitten voldoende is om het in vivo cholestatisch potentieel van een molecule te bepalen. Dit is echter een veel te eenvoudige voorstelling. Deze modellen beperken DIC immers tot de interferentie met één of meerdere hepatische transporteiwitten, terwijl galzouthomeostase in werkelijkheid een uitgebreider netwerk aan processen omvat. Deze tekortkoming kan verholpen worden door gebruik te maken van meer in vivo-relevante in vitro modellen, zoals humane hepatocyten in sandwich-cultuur (sandwich-cultured human hepatocytes, SCHH). Onze onderzoeksgroep heeft gedurende de voorbije jaren een op SCHH gebaseerd in vitro model ontwikkeld. Dit model is in staat om cholestase-inducerende moleculen te identificeren. Hoewel de methode cholestatische moleculen kan onderscheiden van levertoxische maar niet-cholestatische en niet-levertoxische verbindingen, kan aan de hand van deze methode geen mechanistisch inzicht verworven worden in wijzigingen in galzouthomeostase. Dergelijke informatie is zeer waardevol, zeker wanneer men een geïnformeerde beslissing over het cholestatisch potentieel van een nieuw geneesmiddel dient te maken. Het overkoepelende doel van dit proefschrift is dan ook om relevante in vitro galzoutdispositie- data te genereren en deze te analyseren, gebruik makende van zowel standaard niet-compartimentele analysetechnieken als een meer geavanceerd cellulair mechanistisch dispositiemodel. Dit moet toelaten een beter inzicht te verkrijgen in DIC. De in vitro gegevens werden verkregen door middel van een verbeterde experimentele opstelling die bestond uit het incuberen van de prototypische galzouten chenodeoxycholzuur (CDCA) en diens conjugaat glycochenodeoxycholzuur (GCDCA) in aan- en afwezigheid van therapeutisch relevante bosentan-concentraties.Daar gecryopreserveerde humane levercellen (hepatocyten) in dit proefschrift werden gebruikt, werd in een eerste studie nagegaan of gecryopreserveerde levercellen een betrouwbaar alternatief zijn voor vers- geïsoleerde cellen. De resultaten van dit onderzoek toonden duidelijk aan dat cryopreservatie geen noemenswaardig effect had op de biochemische integriteit of het in vitro toepassingspotentieel van de cellen. Bovendien toonden transporterstudies aan dat de activiteit van de organic anion transporting polypeptide (OATP) en de multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2) ongewijzigd bleef na cryopreservatie. In dezelfde studie werd de dispositie van telmisartan en telmisartan-glucuronide geëvalueerd door middel van een cellulair mechanistisch dispositiemodel. Hierdoor konden we nagaan of specifieke dispositieroutes veranderden na cryopreservatie. Het model voorspelde dat de relatieve bijdrage van opname, metabolisme en efflux van telmisartan en telmisartan-glucuronide ongewijzigd bleef na cryopreservatie. Dit geeft aan dat gecryopreserveerde levercellen een geschikt alternatief zijn voor vers-geïsoleerde cellen. Naast het bepalen van de effecten van cryopreservatie op de functionaliteit van hepatocyten, werd in deze studie ook een generiek mathematisch raamwerk ontwikkeld dat gebruikt kon worden in toekomstige studies. In een tweede studie werd dit raamwerk gebruikt om een mechanistisch dispositiemodel te ontwikkelen dat in staat was om de effecten van bosentan op de dispositie van CDCA en GCDCA kwantitatief te bepalen. Het model bestond uit zeven compartimenten waarnaar CDCA en GCDCA zich konden verdelen met behulp van zowel lineaire als niet-lineaire kinetiek. Het model voorspelde dat de conjugatie van CDCA evenals de canaliculaire secretie van GCDCA afnam in aanwezigheid van bosentan. Deze bevindingen waren bovendien in overeenstemming met de niet-compartimentele analyseresultaten en rapporten van andere onderzoeksgroepen. Tijdens deze studie werd de galzoutdispositie echter niet in alle geteste donoren beïnvloed door bosentan. Dit toont het belang aan van het gebruik van in vivo-relevante in vitro modellen bij de beoordeling van DIC. Soortgelijke waarnemingen werden gemaakt in een laatste studie. Hier wilden we nieuwe inzichten verwerven in de rol van Ro 47-8634 (O-demethylatie van bosentan), Ro 48-5033 (hydroxylatie van bosentan) and Ro 64-1056 (combinatie of hydroxylatie and O-demethylatie van bosentan), de drie fase I metabolieten van bosentan, in de totale toxische respons van bosentan. Ook hier werd de dispositie van CDCA en GCDCA in aanwezigheid van bosentan geëvalueerd met behulp van SCHH die afkomstig waren van drie donoren met verschillende metabole capaciteiten. Zoals verwacht vormde de donor met de grootste metabole capaciteit de grootste hoeveelheid metabolieten. Dit was echter ook de enige donor die een significante afname vertoonde in de opname van CDCA en daaropvolgende conjugatie naar GCDCA na behandeling met bosentan, wat suggereerde dat de vorming van Ro 47-8634, Ro 48-5033 en/of Ro 64-1056 aan de basis zou kunnen liggen van de waargenomen effecten. Regressie analyse toonde aan dat de afname in de opname van CDCA, althans gedeeltelijk, kon worden toegeschreven aan de vorming van Ro 47-8634, Ro 48-5033 en/of Ro 64-1056, terwijl de afname in de conjugatie van CDCA hoogstwaarschijnlijk het gevolg was van directe interactie met bosentan.Door gebruik te maken van een verbeterde experimentele opstelling die bestond uit het incuberen van SCHH met CDCA in aan- en afwezigheid van therapeutisch relevante bosentan concentraties, gaf dit proefschrift nieuwe inzichten in DIC. Door subtiele wijzigingen in de dispositie van CDCA en GCDCA te kwantificeren met behulp van niet-compartimentele analysetechnieken en een cellulair mechanistisch dispositiemodel, werden nieuwe inzichten verworven in het samenspel van de toxiciteitsmechanismen van bosentan. Zo bleek dat de vorming van Ro 47-8634, Ro 48-5033 en Ro 64-1056 potentieel een rol speelt in de geobserveerde wijziging in galzoutopname, terwijl dat de afname in de verdere conjugatie van niet-geconjugeerde galzouten naar diens geconjugeerde vorm hoogstwaarschijnlijk het gevolg zijn van interferentie door bosentan. " "Gerobotizeerd Humaan Lever-Mimic 3D Model Platform voor efficiënte NAFLD- en DILI-drug screening" "Catherine Verfaillie" "Onderzoekscentrum voor Skeletale Biologie en Engineering, Stamcel- en Ontwikkelingsbiologie" "In deze studie wensen we een volledig geautomatiseerde, volledig geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) -3D- leverrijping hydrogel (HepMAT) levermodel te ontwikkelen dat kan worden gebruikt om steatose in de lever, ontsteking en leverfibrose te veroorzaken, zoals wordt gezien bij niet-alcoholische leververvetting en steatohepatitis (NAFLD / NASH) die geschikt zijn voor de ontwikkeling van geneesmiddelen tegen deze momenteel onbehandelbare en veel voorkomende ziekte. Bovendien zal het platform het mogelijk maken de toxische effecten van geneesmiddelen op de lever (door geneesmiddelen veroorzaakte leverbeschadiging (DILI), de belangrijkste oorzaak van drug falen van drugs in een laat stadium van de ontwikkeling en postmarketing van geneesmiddelen. Het platform is gebaseerd op nieuwe technologieën die de afgelopen 5 jaar zijn ontwikkeld in ons lab, waardoor hepatocyten uit iPSC's kunnen worden aangemaakt met dezelfde sensitiviteit en specificiteit om toxiciteit van geneesmiddelen te bepalen als primaire humane hepatocyten (PHH) en met metaboliserende capaciteit van geneesmiddelen vergelijkbaar aan PHH's; alsook de creatie van een uniek, volledig gedefinieerd op hydrogel gebaseerd 3D-kweeksysteem dat iPSC-PSC-hepatocyten, -endotheel cellen, -stellaire cellen en -macrofagen, die op een zeer robuuste manier kunnen reageren op inflammatoire, steatotische en fibrogene triggers (genaamd HepMat-culturen). In deze C3-aanvraag worden deze iPSC-3DHepMAT liver cultures geminiaturiseerd en gerobotiseerd en intern gevalideerd / gebenchmarkt op hun geschiktheid om NAFLD / NASH-achtige ziektemodellen te creëren die geschikt zijn voor het testen van medicijnen tegen NAFLD / NASH identificeren met hoge specificiteit en DILI-veroorzakende chemicaliën. De unieke verkoopargumenten van het model zijn (1) dat het niet lijdt aan variaties tussen donoren en batches, wat onvermijdelijk is bij het gebruik van primaire levercellen (zoals in het serviceaanbod van onze concurrenten); en (2) het systeem kan worden ontworpen met fluorofoorcassettes die high-content imaging mogelijk maken van tijdsafhankelijke, cel- en stress-path-specifieke effecten van geneesmiddelen en metabole veranderingen." "Modelgeïnformeerde geneesmiddelontwikkeling: toepassing op door geneesmiddelen geïnduceerde cholestase" "Pieter Annaert" "Farmacotechnologie en Biofarmacie" "Geneesmiddelgeïnduceerde leverbeschadiging (DILI) kan de leverfunctie aantasten en tot leverfalen of zelfs de dood leiden, wat een aanzienlijke belasting voor het gezondheidszorgsysteem met zich meebrengt. Bovendien kunnen kandidaat-geneesmiddelen die de lever beschadigen, klinische proeven beëindigen, worden afgekeurd of uit de handel worden genomen, wat beide aanzienlijke verliezen voor de farmaceutische bedrijven veroorzaakt. Om de veiligheid van geneesmiddelen te verbeteren en het verloop tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen tot een minimum te beperken, is het essentieel om benaderingen te ontwikkelen om het risico op DILI in een vroeg stadium te detecteren. Aangezien cholestase doorgaans gepaard gaat met veranderde galzuurhomeostase, worden geneesmiddelinteracties die de dispositie van galzuren moduleren beschouwd als een belangrijk onderliggend mechanisme van DILI. Het is consequent dat vroege detectie van verstoorde galzuurhomeostase het potentieel van DILI veroorzaakt door een medicijn (kandidaat) kan informeren. In silico-modellering en simulatie kunnen de bevindingen van in vitro, in vivo dierstudies translationeel worden geïntegreerd in klinische studies en de bottom-up voorspelling van in vivo risico's mogelijk maken. Daarom is het doel van dit doctoraatsproject (1) het ontwikkelen van een bottom-up fysiologisch gebaseerde (farmaco)kinetische (PB(P)K) modelleringsstrategie voor galzuren en geneesmiddelen in speciale populaties; (2) omgaan met de variabiliteit van patiënten bij het voorspellen van de blootstelling aan geneesmiddelen; (3) mechanistische kennis over DIC- en PB(P)K-modellering integreren om in vivo DIC-risico te voorspellen. Uiteindelijk wordt verwacht dat dit doctoraatsproject informatie zal geven over de veiligheid van geneesmiddelen in een vroeg stadium van de ontwikkeling van geneesmiddelen."