Titel Promotor Affiliaties "Korte inhoud" "RNA gentherapie in een model van RNA-Based Gene Therapy in een model van het syndroom van Usher" "Catherine Verfaillie" "Stamcel- en Ontwikkelingsbiologie" "Usher syndroom is de meest voorkomende oorzaak van gecombineerde doof- en blindheid in mensen. USH is gecategoriseerd in drie verschillende subtypes, gebaseerd op de graad van gehoorverlies en de aanwezigheid van vestibulaire disfunctie. Het gehoorverlies, als gevolg van mutaties in verschillende USH genen, wordt veroorzaakt door de desorganisatie van de bundels van cochlaire haarcellen. In alle drie de USH subtypes wordt de visuele beperking veroorzaakt door retinitis pigmentosa (RP). Mutaties in USH2A is de meest voorkomende oorzaak van USH en de recessieve vorm van RP. In vivo gen editie, gebruikmakend van programmeerbare nuclei zoals CRISPR/Cas9 technologie, biedt een  oplossing door precieze reparatie van het gen in plaats van het bezorgen van een genetisch gecorrigeerd groot cDNA molecuul. Dit project heeft als doel om gen reparatie uit te voeren, in zowel het in vitro als het dieren model van USH2, door het bezorgen van de 'CRISPR tool' aan de fotoreceptoren via nanodeeltjes." "Een genbewerkingstrategie voor refractaire CFTR-mutaties die cystische fibrose veroorzaken." "Zeger Debyser" "Moleculaire Virologie en Gentherapie" "Het doel van ons project is om CRISPR-Cas genbewerkingstherapie te ontwikkelen voor CFTR-mutaties die ongevoelig zijn voor de huidige CFTR-modulatoren. Een functionele redding zal worden beoordeeld in menselijke CF intestinale organoïden en luchtwegculturen." "Doelgerichte aanpassing van het PSIP1 gen coderend voor LEDGF/p75 beschermt cellen tegen HIV infectie." "Rik Gijsbers" "Switch Laboratorium (VIB-KU Leuven), Moleculaire Virologie en Gentherapie, Adaptieve Immunologie" "Gentherapie heeft de laatste jaren getoond dat het een behandeling, en soms genezing, kan voorzien voor ziekten die anders onbehandelbaar of zeer moeilijk te behandelen zijn. De ontdekking Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), de ontrafeling van het mechanisme achter het CRISPR-gebaseerde prokaryote adaptieve immuunsysteem (CRISPR-associated system, Cas) en het omvormen van dit systeem tot een efficiënt gene editing platform, heeft gezorgd voor een omwenteling in de moleculaire biologie en het ontwikkelen van verbeterde en nieuwe gentherapiën. Het gebruiksgemak en de flexibiliteit van het CRISPR/Cas9 nuclease systeem heeft geleid tot toepassingen in bijna alle onderzoeksdomeinen in de biologie, zoals de ontwikkeling van cel-gebaseerde modellen, ontrafelen van ziektemechanismen, identifcatie van specifieke doelwitten, het genereren van transgene diermodellen en planten, en het moduleren van transcriptie. Het humaan immunodeficiëntie-virus (HIV) maakt gebruik van cellulaire co-factoren om zijn infectie cyclus succesvol af te ronden. Interfereren met deze co-factoren is een effectieve manier om cellen te beschermen tegen HIV infectie, zoals werd aangetoond bij de natuurlijk voorkomende CCR5del32 mutaties en ablatie van CCR5 met behulp van Zn-vinger nucleases. Een van de toepassingen voor CRISPR/Cas9 is het sleutelen aan immuuncellen in de strijd tegen HIV/AIDS.LEDGF/p75 is een cellulaire co-factor, gecodeerd door het PSIP1 gen, die door het lentivirale integrase (IN) eiwit als deel van het HIV pre-integratie complex gebruikt wordt om zich te hechten aan het chromatine van de geïnfecteerde cel waardoor integratie vergemakkelijkt. LEDGF/p75 depletie resulteerd in defectieve HIV replicatie. In de cel functioneert LEDGF/p75 als verankering voor cellulaire eiwitten en hun respectievelijke proteïne-complexen met het gastheer genoom. Naast CRISPR KO, onderzochten we plaats-specifieke editing van het PSIP1 locus met behulp van CRISPR, waarbij het codon voor aspartaat op position 366 veranderd werd in asparagine (D366N). HIV IN kan niet binden aan LEDGF D366N, terwijl de cellulaire functie van LEGDF/p75 niet geaffecteerd wordt. In de resulterende LEDGF D366N cellen toonden we aan dat HIV-IN niet langer bond, terwijl de interactie met cellulaire bindingspartners onveranderd bleef. Zoals bij LEDGF/p75 knock-out cellen, was er geen HIV replicatie in LEDGF D366N cellen, gedeeltelijk omwille van de verminderde HIV integratie. De provirussen die toch nog integreerden onder deze condities vertoonden een verwaarloosbare of geen transcriptionele activiteit.Deze resultaten onderstrepen het potentieel van plaats-specifieke CRISPR/Cas9-gemedieerde knock-in om cellen te beschermen tegen virale infectie, en tonen aan dat mutatie van LEDGF/p75 een additionele strategie is die gebruikt kan worden om patiënt-afgeleide T-cellen te beschermen tegen HIV-1 infectie als onderdeel van een cell-gebaseerde therapie." "Gen therapeutische interventie tijdens ex vivo long perfusie als een platform voor het moduleren van menselijke longziekte" "Marianne Carlon" "Respiratoire Aandoeningen en Thoraxheelkunde (BREATHE), Moleculaire Virologie en Gentherapie" "Longtransplantatie (LTx) is de meest effectieve therapie om patiënten met een ernstige longziekte te behandelen. LTx gaat echter gepaard met een laag overlevingspercentage. Primaire greffe-dysfunctie (PGD) is een ernstige vorm van acute longschade na LTx en is een van de hoofdoorzaken van de lage overleving. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt in het inzicht in de risico's en mechanismen van PGD, is er nog steeds geen effectieve behandeling. Ex-vivo longperfusie (EVLP) houdt de donorlongen in een fysiologische en metabole toestand en biedt een uniek platform om behandelingsinterventies aan te bieden om PGD te voorkomen. Met een CRISPR-gebaseerde genoom-editing strategie, willen we het potentieel van het uitschakelen van PGD-gerelateerde genen (bv. IL-6) tijdens EVLP bestuderen. In dit doctoraatsonderzoek zullen twee verschillende ‘delivery vehicles’ onderzocht worden om de CRISPR-Cas9 machinerie efficiënt maar tijdelijk in de cellen van de long te introduceren: adeno-geassocieerde virale (rAAV) vectoren en Virus-Like Particles (VLPs). Na in vitro optimalisatie van de delivery, door middel van reporter-gen expressie, trachten we na te onderzoeken of CRISPR-Cas9 gen knock-out (gericht tegen een PGD-gen van belang) de ernst van PGD kan verminderen, zowel in vitro als in vivo." "Het gentherapie-innovatietrainingsnetwerk" "Rik Gijsbers" "Moleculaire Virologie en Gentherapie" "Gene therapy has transitioned from a distant hope to reality. To date 3 rAAV gene therapies are approved in the EU, >30 phase III clinical trials ongoing, and exciting developments in therapeutic gene editing in the pipeline. However, fundamental limitations in the bioprocessing of gene therapy vectors limit broader application. Manufacturing is not automated, with an open process environment, limited scalability and robustness, and inefficient downstream processing, resulting in huge footprint and exceedingly high cost of goods. The field requires scalable manufacturing technology with modular design to produce high doses for large patient groups at a fraction of cost. Improved delivery approaches with increased specificity and efficacy at lower doses are needed to overcome emerging safety concerns observed in clinical trials. Prediction of therapeutic efficacy in man is challenging due to a species barrier, underlining the need for humanized models to reduce attrition rates in the development pipeline.To overcome these challenges, innovation driven by multidisciplinary approaches is direly needed. GET-IN is a doctoral network of 7 academic and 8 non-academic partners, with expertise in vectorology, genome editing, process engineering, biomanufacturing and innovative humanized models. Together, they provide an excellent training framework for 10 Doctoral Candidates (DCs) who will be the future innovators in the gene therapy field. Research in GET-IN will investigate disruptive innovations including optimised bioprocessing, digital simulation, novel and improved vectors and genome editors, targeted delivery systems, and human organ-on-chip models for more relevant safety and efficacy evaluation. The joint training programme will emphasise responsible, cooperative research and innovation, creativity, and entrepreneurship to maximize the career potential of the DCs." "Inzicht in de pathogenese van gamma-herpesvirus en de ontwikkeling van nieuwe behandelingsstrategieën." "Graciela Andrei" "Laboratorium Virologie en Chemotherapie (Rega Instituut)" "Tot op heden zijn er twee gekende humane γ-herpesvirussen, het Epstein-Barr virus (EBV) en het Kaposi-sarcoma geassocieerd virus (KSHV). EBV is het eerst beschreven in 1964 in een weefsel van endemisch Burkitt-lymfoom. De eerste beschrijving van Kaposi sarcomen dateert van 1872, hoewel slechts in 1994, KSHV was erkend als de oorzaak van de ziekte.Een primaire EBV is het meest gekend om infectieuze mononucleose (klierkoorts) te veroorzaken bij jongvolwassenen en volwassenen. Een KSHV primaire infectie is minder goed gedefinieerd en de symptomen zijn onder andere koorts, lymfadenopathie en macupapulaire uitslag. Bij immuuncompetente individuen, volgt er na de initiële infectie een evenwicht tussen het immuunsysteem en het virus, met overleving van het virus maar zonder ziekteverschijnselen. Dit is niet het geval bij immuungecompromitteerde patiënten, waarbij een latente infectie geassocieerd wordt met de ontwikkeling van verschillende lymfoproliferatieve aandoeningen en epitheliale/endotheliale kankers.Door de hoge impact van γ-herpesvirus geassocieerde aandoeningen, is er nood aan meer basisonderzoek aangaande de humane γ-herpesvirussen, maar ook aan nieuwe therapeutische strategieën zoals de ontwikkeling van vaccins, virus-specifieke kankerbehandelingen en antivirale middelen. Het gebrek aan EBV- en KSHV-gerichte behandelingsstrategieën kan worden toegeschreven aan het ontbreken van een in vitro celcultuur systeem dat efficiënte virale replicatie toestaat. Om dit probleem op te lossen worden γ-herpesvirussen vaak bestudeerd door het gebruik van surrogaat virussen zoals het murine γ-herpesvirus-68 (MHV-68). In deze thesis worden verschillende aspecten van γ-herpesvirus antivirale middelen onderzocht. Gebruikmakend van MHV-68, onderzochten we antivirale resistentie ontwikkeling tegen zowel gekende nucleoside, nucleotide als pyrofosfaat analogen, en evalueerden de impact van geneesmiddel-resistente virussen op de γ-herpesvirus virale replicatie. Daarnaast werden er verschillende factoren geïdentificeerd die de activatie van nucleoside analoog cyclisch-HPMPC, kunnen beïnvloeden door gebruik te maken van verschillende EBV-geïnfecteerde B-cellijnen afkomstig van Burkitt-lymfomen.Eerst, onderzochten we de impact van specifieke mutaties in MHV-68 virale thymidine kinase (TK) of proteïne kinase (PK) op de virale replicatie capaciteit. De mutaties in dit hoofdstuk, zijn in voorafgaand onderzoek in ons laboratorium geïdentificeerd. De virale replicatie capaciteit werd bepaald door wild-type en geneesmiddel-resistente virussen samen te laten groeien in de afwezigheid of aanwezigheid van verschillende antivirale middelen (dubbele infectie competitietesten), waarbij de samenstelling van de gemengde virale populatie werd bepaald door next-generation sequencing.Daarna, werd het resistentiemechanisme onderzocht van MHV-68 tegen bepaalde nucleoside (ganciclovir), nucleotide (cidofovir, HPMP-5azaC, HPMPO-DAPy) en pyrofosfaat (foscarnet) analogen en werd de impact van deze geneesmiddel-resistente mutaties gelokaliseerd in het virale DNA polymerase (DP) op de virale replicatie capaciteit geëvalueerd. Twee geneesmiddel-resistente virale isolaten, gelinkt aan de DP aminozuur veranderingen C297W en C981Y, werden geïdentificeerd als virussen met een verlaagde replicatiefideliteit (mutator fenotype virussen). Het mutator fenotype veroorzaakt door aminozuurverandering C297W werd gevalideerd door gebruik te maken van CRISPR/Cas9 genome editing.Tenslotte, in het derde hoofdstuk evalueerden we het effect van een enkel-nucleotide polymorfisme die aanleiding geeft tot de heterozygote aminozuurverandering Q207R op het vermogen van het cellulair 2',3'-cyclisch-nucleotide 3'-fosfodiesterase (CNPase) om cyclisch-HPMPC te metaboliseren. Daarnaast identificeerden we een verband tussen expressie van EBV latente proteïnes en CNPase proteïne expressie en vermogen om cyclisch-HPMPC te metaboliseren. CNPase is deel van de 2′,3′-cAMP-adenosine pathway en katalyseert in vitro de omzetting van nucleoside 2′,3′-cyclisch monofosfaten naar nucleoside 2′-monofosfaten. Echter, in vivo is de functie van het cellulair CNPase grotendeels onbekend en het fysiologisch substraat is nog niet bepaald. Hiernaast stelden we vast dat de Jiyoye cellijn niet homogeen is doordat deze een subpopulatie bevat met een gewijzigd latentie type, veroorzaakt door een 14 kb deletie van het virale genoom, en die geïntegreerd is in het cellulaire genoom.Aangezien geneesmiddelen-resistentie inherent is aan virussen, is onderzoek naar antivirale resistentie en de impact van resistentie op virale fitness cruciaal. Onze resultaten stelde ons in staat om mutatie patronen tussen verschillende herpesvirussen te vergelijken en zorgden voor een dieper begrip van de impact van resistentie en antivirale druk op virale fitness. Daarenboven toonden we aan hoe cellulaire en/of virale factoren de activatie van cyclische prodrugs kunnen beïnvloeden."