Serological markers in inflammatory bowel disease

De ziekte van Crohn (CD) en colitis ulcerosa (UC) zijn de belangrijkste vertegenwoordigers van een groep van inflammatoire darmaandoeningen of I BD. Deze aandoeningen worden gekarakteriseerd door een chronische ontste king van de gastro-intestinale tractus. Ondanks veelvuldig onderzoek naar deze aandoeningen, blijft de oorzaak t ot op heden nog ongekend. Hierdoor worden inflammatoire darmaandoeningen gediagnosticeerd door eliminatie van andere, acute, aandoeningen met ge lijkaardige symptomen, zoals darminfecties, kanker, prikkelbaar darmsynd room,.. Hiervoor wordt een combinatie van endoscopie, bloedanalyse, hist ologische en radiologische onderzoeken gebruikt. Doordat de oorzaak nog onbekend is blijft de behandeling van IBD patiënten symptomatisch en kan de ziekte niet genezen worden. De hypothese is dat IBD veroorzaakt wordt door een overreactie van het i mmuunsysteem tegen de commensale bacteriën in de darm van een genetisch voorbestemd individu. Verschillende genetische defecten zijn beschreven in het aangeboren en adaptieve immuunsysteem bij IBD patiënten, zoals ee n mutatie in het NOD2 gen, die voorkomt bij 1 op 3 CD patiënten. De invl oed van het immuunsysteem wordt gekarakteriseerd door de aanwezigheid va n verschillende antistoffen in het serum van IBD patiënten, gericht tege n autoantigenen en/of microbiële antigenen. De meest bestudeerde antisto ffen zijn atypische perinucleaire anti-neutrofiele cytoplasmatische anti stoffen (pANCA) en anti-Saccharomyces cerevisiae antistoffen (ASCA) . Atypische pANCA antistoffen komen voor bij 60-80% van de UC patiënten, 5-25% van de CD patiënten en 3-4% van gezonde mensen. ASCA worden terug gevonden in het serum van 50-80% van CD patiënten, in minder dan 10% van UC patiënten en in 5% van gezonde controles. Atypische pANCA kunnen een goede diagnostische merker zijn voor IBD, al wordt het nut van deze mer ker geminimaliseerd door de manier waarop deze antistoffen gemeten worde n, namelijk indirecte immuunfluorescentie met neutrofielen als substraat . Deze techniek is weinig gestandaardiseerd en het resultaat is afhankel ijk van de interpretatie van de laborant. Het gebruik van pANCA als diag nostische test zou vergemakkelijkt worden indien een meer gestandaardise erde en reproduceerbare techniek, zoals ELISA, kan gebruikt worden. Om d ergelijke ELISA-test te ontwikkelen moet het targetantigen van pANCA geï dentificeerd worden. Bovendien kan deze identificatie antwoorden bieden op verscheidene vragen betreffende de pathogenese van IBD. Het doel van dit doctoraat was het bestuderen van de gekende antistoffen (pANCA) en hun antigenen en het beschrijven van nieuwe antistoffen in I BD patiënten. In een eerste project werd gezocht naar het targetantigen van pANCA anti stoffen. Hiervoor werd door middel van 2D gel elektroforese de seroreact iviteit tegen neutrofielen vergeleken tussen een sterk pANCA positieve U C patiënt en een gezonde controle. In de UC patiënt werd een sterke sero reactiviteit gedetecteerd tegen een 50kD proteïne, geïdentificeerd als a lfa-enolase door middel van massaspectrometrie. De gezonde controle vert oonde geen seroreactiviteit tegen dit proteïne. Ter confirmatie werd een cohort van 525 patiënten en controles gescreend op 1D gel elektroforese en western blotting voor antistoffen tegen recombinant alfa-enolase. De ze antistoffen werden gedetecteerd in 49.0% van de UC patiënten, 50.0% v an de CD patiënten en 8.5% van de gezonde controles. Om de specificiteit van deze antistoffen te evalueren werden eveneens patiënten met acute g astro-intestinale inflammatie (inflammatoire controles) en patiënten met ANCA-geassocieerde aandoeningen gescreend. Antistoffen tegen alfa-enola se werden teruggevonden in 31.0% van de inflammatoire controles, in 30.5 % van patiënten met primaire scleroserende cholangiitis, in 37.8% van pa tiënten met auto-immuun hepatitis en in 34.0% van patiënten met ANCA-pos itieve vasculitis. We concludeerden dat, ondanks de goede sensitiviteit van alfa-enolase antistoffen in IBD patiënten, het diagnostisch nut van deze antistoffen beperkt is door de hoge prevalentie in de inflammatoire controles. De techniek van 2D gel elektroforese en western blotting werd geoptimali seerd en toegepast op het screenen van antistoffen tegen neutrofielen in 5 pANCA positieve UC patiënten, 5 pANCA negatieve UC patiënten, 3 gezon de en 2 inflammatoire controles. We vonden een sterke seroreactiviteit i n pANCA positieve UC patiënten gericht tegen 6 antigenen, waaronder 5 gl ycolytische enzymen (aldolase A, triose-fosfaat isomerase, fosfoglyceraa t mutase, alfa-enolase en pyruvaat kinase), en malaat dehydrogenase. Ter bevestiging werd 60 UC patiënten, 60 CD patiënten, 60 gezonde en 60 inf lammatoire controles getest voor antistoffen tegen deze 6 antigenen, doo r middel van western blotting. Antistoffen tegen aldolase A, fosfoglycer aat mutase, alfa-enolase, triose-fosfaat isomerase en malaat dehydrogena se kwamen meer voor bij patiënten dan controles. Seroreactiviteit tegen ten minste 1 van deze 5 antigenen werd gedetecteerd in 53.3% van de UC p atiënten, 38.3% van de CD patiënten en in 8.3% van de controles. Serorea ctiviteit tegen 2 of meer antigenen werd gedetecteerd in 16.7% van de UC patiënten, 11.7% van de CD patiënten, maar niet bij de controles. Anti- aldolase A antistoffen werden gedetecteerd in het serum van 18.3% van de UC patiënten en slechts bij 1.7% van de CD patiënten. Bovendien werden deze antistoffen niet teruggevonden bij 8 CD patiënten waarbij de ziekte beperkt blijft tot het colon. Mogelijk kunnen deze antistoffen helpen i n het diagnosticeren van patiënten met indeterminate colitis. Patiënten met indeterminate colitis vertonen inflammatie van het colon, maar het o nderscheid tussen UC en CD kan niet gemaakt worden op basis van klinisch onderzoek. Een andere interessante observatie is de verhoogde mRNA expressie van de ze glycolytische enzymen in mucosale colon biopten van IBD patiënten ten opzichte van controles. Bovendien was ook het mRNA van HIF-1 alfa signi ficant verhoogd in deze biopten. HIF-1 alfa is een transcriptiefactor vo or verscheidene genen die coderen voor glycolytische enzymen, zoals aldo lase A, fosfoglyceraat mutase, alfa-enolase en pyruvaat kinase. Men kan veronderstellen dat mucosale hypoxie, welke voorkomt in IBD patiënten te n gevolge van verhoogd weefsel metabolisme en vasculitis, de expressie v an HIF-1 alfa induceert. HIF-1 alfa kan dan op zijn beurt de expressie v an glycolytische enzymen stimuleren, wat een auto-immuun respons zou opw ekken. In een derde project werd de proteïne microarray technologie geëvalueerd voor de detectie van nieuwe antistoffen bij patiënten met IBD. Proteïne microarrays zijn gebaseerd op nitrocellulose plaatjes gecoat met 8000 h umane proteïnen, als een substraat voor screening van antilichamen. In e en preliminair experiment werden 10 UC patiënten met een sterk pANCA pat roon op een indirecte immuunfluorescentie, 15 CD patiënten, waarvan 10 m et een sterke ASCA seroreactiviteit en 5 met anti-pancreas antilichamen, en 5 gezonde controles (negatief voor pANCA, ASCA en PAB) gescreend op de proteïne microarray. De signaalintensiteiten voor elk proteïne in de 30 geteste individuen we rden geanalyseerd met 2 statistische methoden. We weerhielden 20 proteïn es, welke significant meer voorkwamen bij patiënten dan bij controles, v oor verdere analyse. Een cohort van 60 UC patiënten, 60 CD patiënten, 60 gezonde en 60 inflammatoire controles werden gescreend op een custom mi croarray voor antistoffen tegen de 20 geselecteerde proteïnes. Voor anti stoffen tegen 15 antigenen waren er geen of kleine verschillen in de sig naalintensiteit tussen patiënten en controles op de custom proteïne micr oarray. Voor antistoffen tegen 5 antigenen, cell division cycle2, (CDC2) , NECAP endocytosis associated 1 (NECAP1), family with sequence similari ty 84 member A (FAM84A), plekstrin homology-like domain family A member 1 (PHLDA1) en pyruvaat dehydrogenase (PDH), werd een sterkere seroreacti viteit gevonden in IBD patiënten in vergelijking met gezonde controles. Voor FAM84A, PHLDA1 en PDH was het verschil in seroreactiviteit sterk si gnificant (p<0.001). Daarom werden patiënten en controles getest voor an tistoffen tegen deze 3 proteïnes door middel van western blotting (voor FAM84A en PHLDA1) of ELISA (PDH). De diagnostische waarde van antistoffe n tegen FAM84A, PHLDA1 en PDH is beperkt. De sensitiviteit voor IBD van deze 3 merkers, met een cut off waarde die overeenkomt met een specifici teit van 95.0 % in gezonde controles, is 26,7 %, 20,0 % e n 18, 3 %, voor FAM84A, PHLDA1 en PDH, respectievelijk. Screening v oor een combinatie van FAM84A en PDH had een sensitiviteit van 41.7 % met een specificiteit van 90.0 % voor de gezonde en 93.3 % voor inflammatoire controles. Tenslotte werd in een vierde project gekeken naar seroreactiviteit geric ht tegen microbiële organismen, aangezien men er steeds meer van overtui gd is dat microbiële organismen een belangrijke rol spelen in de ontwikk eling van IBD en het chronische karakter van deze aandoening. Verscheide ne microbiële organismen wordt verondersteld een rol te spelen in IBD, m et inbegrip van Faecalibacterium prausnitzii, een commensale bacter ie die in een verlaagde hoeveelheid wordt teruggevonden in de mucosa-gea ssocieerde microbiota en de fecale microbiota in IBD patiënten, in verge lijking tot gezonde controles. Wij detecteerden een sterke algemene sero reactiviteit tegen F. prausnitzii in onze patiënten en controles. Echter , immuunreactiviteit tegen 1 specifiek proteïne was significant meer aan wezig bij IBD patiënten dan controles. Deze immuunreactiviteit werd gede tecteerd in 9 (56.2%) van 16 CD patiënten in 4 (66,7%) van 6 UC patiënte n, in 1 (16,7%) van 6 inflammatoire controles en niet bij de 14 gezonde controles. Tot besluit hebben wij verscheidene nieuwe antilichamen in inflammatoire darmaandoeningen geïdentificeerd met behulp van de klassieke 2D gel ele ktrophorese en de recent ontwikkelde techniek van de proteïne microarray . Deze antilichamen zijn gericht tegen glycolytische enzymen (alfa-enola se, aldolase A, pyruvaat kinase, triose-fosfaat isomerase en phosphoglyc eraat mutase) en malaat dehydrogenase, FAM84A, PDH en PHLDA1 en een spec ifiek antigeen van F. prausnitzii. We hebben ook aangetoond dat de sensi tiviteit en specificiteit van deze merkers verbeterd wanneer de merkers gecombineerd worden in panels. Tenslotte moeten bijkomende experimenten uitwijzen wat de preklinische, diagnostische, prognostische en pathogene rol is van deze antistoffen in IBD.

Jaar van publicatie:2010

Toegankelijkheid:Closed