Detection, separation and sequencing of oligosaccharides in beer

De volmondigheid van een bier wordt ondermeer bepaald door de oligosachariden van het restextact (1). Drie krachtige methoden werden gecombineerd om het complexe sacharideprofiel in bier weer te geven: HPAEC-PAD (High pH Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric detection), DSA-FACE (Fluorescent Assisted Carbohydrate Electrophoresis uitgevoerd op een capillaire array DNA Sequenator) en MALDI TOF MS (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation with Time-of-Flight Mass Spectrometer). De sacharidesamenstelling van verschillende bieren werd met elkaar vergeleken en oligosachariden uit één type bier werden preparatief gescheiden aan de hand van Carbograph-SPE (Solid Phase Extraction) en gelfiltratie. De bekomen sachariden werden enzymatisch gesequeneerd. Met HPAEC-PAD worden sachariden gescheiden op basis van hun lading en structuur. De detectie gebeurt zonder voorafgaande derivatisering wat massaspectrometrische analyse van de sachariden toelaat na de scheiding. De detectiegrens voor malto-oligosachariden bedraagt 10 pmol en de resolutie voor de malto-oligosachariden in bier met DP<10 is zeer goed (Figuur 1, links). Carbohydraatelektroforese op DNA sequeneringsapparatuur laat toe om met zeer hoge gevoeligheid en resolutie glycaanmengsels te "fingerprinten". Deze analysetechniek werd oorspronkelijk geperfectioneerd voor complexe N-glycaanmengsels (2) en werd in dit werk toegepast op de oligosachariden in bier. De suikers worden vooraf gederivatiseerd met het fluorescent label APTS (9-aminopyrene-1,4,6-trisulfonaat). De detectiegrens voor de malto-oligosachariden bedraagt 10 fmol en de resolutie blijft bewaard met stijgende grootte van de sachariden (Figuur 2, rechts). Met MALDI-TOF MS wordt de massa van de oligosachariden bepaald zonder risico tot fragmentatie. De onderzochte bieren verschillen sterk in concentraties aan hogere malto-oligosachariden en isomalto-oligosachariden (Figuur 1). Sommige bieren bevatten veel U+03B1(1U+21924) gebonden en weinig U+03B1(1U+21926) vertakte sachariden, voor andere geldt het omgekeerde. De profielen vertonen niet echt een tendens per type bier. Deze verschillen kunnen hun weerslag hebben op de organoleptische eigenschappen van het bier en in het bijzonder op de volmondigheid. Uit één type bier dat veel U+03B1(1U+21926) vertakte sachariden bevat, werden de oligosachariden met een DP hoger dan 5 preparatief gescheiden op basis van hun moleculair gewicht. De oligosachariden werden geadsorbeerd op koolstof gepakt in een solid phase extraction kolom en geëlueerd met een stapgradiënt van water en n-butanol gesatureerd water (3). De oligosachariden elueerden in stijgende grootte en werden geïsoleerd in batch. De fractie geëlueerd met 1% butanol bestaat bijvoorbeeld uit vier isomalto-oligosachariden. MALDI-TOF MS analyse wijst op een mengsel van een hexa-, hepta-, octa- en nonasachariden. Deze vier oligosachariden elueren als enkelvoudige pieken voor de U+03B1(1U+21924) gebonden malto-oligosachariden (M6-M9) bij HPAEC-PAD analyse. DSA-FACE analyse toont echter dat iedere piek bestaat uit verschillende oligosachariden, waarschijnlijk positie-isomeren met dezelfde DP (Figuur 2). De oligosachariden werden verder gescheiden met Biogel P4 gelfiltratie chromatografie en de scheiding werd opnieuw gecontroleerd met HPAEC-PAD. De afzonderlijke oligosachariden werden enzymatisch gesequeneerd: specifieke enzymen werden gebruikt om de structuur van de oligosachariden op te helderen. De gevormde producten werden geanalyseerd met HPAEC-PAD en DSA-FACE. Zo werd een isomalto-oligosacharide met DP9 (drie pieken op DSA-FACE) na een pullulanase-behandeling enkel omgezet tot maltohexaose en maltotriose. Hieruit kan geconcludeerd worden dat dit DP9-suiker een U+03B1(1U+21924) maltohexaose eenheid is die U+03B1(1U+21926) gesubstitueerd is met een maltotriose eenheid op de O-6 positie van drie verschillende U+03B1(1U+21924) gelinkte glucose residu's. Referenties (1) Van Landschoot, A., Vanbeneden, N., Machtelinckx, M., Stals, I. & Claeyssens, M. (2005) Pecularities of seven refermented Belgian strong ales and their corresponding industrial yeast. Cerevisia, 30, 3, 181-188. (2) Laroy W., Contreras R. and Callewaert N. (2006) Glycome mapping on DNA sequencing equipment. Nature Protocols 397-405. (3) Redmond J.W. and Packer N.H. (1999) The use of solid-phase extraction with graphitised carbon for the fractionation and purification of sugars. Carbohydrate Research 319, 74-79.