< Terug naar vorige pagina

Project

Zebravis als een Model voor Glycosylatiedefecten. Vissen achter de Rol van TMEM165

Aangeboren glycosylatiedefecten (CDG) vertegenwoordigen een heterogene groep van erfelijke ziekten gekenmerkt door foutieve N- en O-glycosylering, en lipidenglycosylering. Defecten in eiwit N-glycosylering, die variëren in ernst en systemische presentatie, worden traditioneel verdeeld in twee groepen. De grootste groep, type I CDG (CDG-I), is het gevolg vandefecten in enzymen die betrokken zijn in de biosynthese van de lipide-gekoppelde oligosaccharide precursor Glc3Man9GlcNAc2-PP-dolichol (G3M9Gn2-PP-Dol) of in de overdracht naar de pas gevormde eiwitketen in het endoplasmatisch reticulum (ER). De tweede groep, type II CDG (CDG - II), ontstaat uit een verstoring van het knippen en plakken van suikers aan de N-glycaanketen in het ER/intermediair compartiment of in de cis-/trans-Golgi cisternen. Bovendien, en in tegenstelling tot CDG-I, blijken deze defecten niet enkel geassocieerd te zijn met glycosylatie-enzymen maar ook met defecten in ER-Golgi of intra-Golgi transport. Als gevolg van dezeontdekkingen verplaatst de interesse in de aangeboren glycosylatiedefecten zich meer en meer in de richting van intracellulair transport en opbouw en functie van het Golgi compartiment. Een bijzondere CDG, veroorzaakt door mutaties in TMEM165, een transmembraan eiwit waarvan de functie ongekend is, is het onderwerp van dit proefschrift.
Via homozygositymapping in combinatie met transcriptoomanalyse op fibroblasten werd ineen Joodse familie met 2 kinderen, een homozygote cryptische splice-mutatie (c.792+182G>A) gevonden in een nieuw gen, nl. TMEM165 (transmembrane protein 165). Deze patiënten vertonen psychomotorische achterstand, dwerggroei en aanzienlijke skeletafwijkingen. Iso-elektrische focussering van serum transferrine toonde een abnormaal patroon dat overeenstemt metCDG-II. De analyse van N-glycanen onthulde een defect in sialylatie en galactosylatie. Bij mutatie-onderzoek bij andere onopgehelderde CDG-II patiënten hebben we nog 3 verschillende missense mutaties ontdekt bij 2 andere patiënten, nl. p.R126H, p.R126C en p.G304R.
TMEM165 codeert voor een eiwit met 324 aminozuren met 6 transmembranaire domeinen. TMEM165 is sterk geconserveerd in eukaryoten en behoort tot UPF0016, een familievan integrale membraaneiwitten van onbekende functie. De functie van het genproduct en de pathofysiologie van deze nieuwe CDG zijn onbekend maar recente experimenten wijzen op een rol in calcium/proton transport in de secretorische pathway. TMEM165 zou een belangrijke rol spelen bij hetbehoud van de Golgi structuur en/of pH.
Ondanks het groeiende inzicht in de moleculaire functie van TMEM165 blijft de fysiologische relevantie van dit eiwit tijdens de ontwikkeling, met name op het skelet, slechtbegrepen. In een poging om meer kennis te verwerven over de fysiologische en pathogene functies van TMEM165, hanteerden we een morfolino-gebaseerde benadering om de expressie van tmem165 te verminderen in zebravis embryos.
Onze resultaten geven aan dat TMEM165 essentieel is voor eengoede kraakbeenontwikkeling. Tmem165-deficiënte embryos vertonen namelijk een verandering in morfologie van verschillende kraakbeenstructuren.Verlies van Tmem165 wordt geassocieerd met een verminderde expressie van het chondroïtinesulfaatproteoglycan aggrecan, evenals verschillende latere markers van zowel kraakbeen- als botmaturatie. Deze defecten resulteerden in verminderde mineralisatie van kraakbeen bij de morfolino-behandelde vissen. Hoewel de defecten in kraakbeen verholpen konden worden door het inbrengen van wild type tmem165 mRNA, kon geen herstel worden waargenomen met tmem165 mRNA dat de missense mutatie R126H bevat. Dit bevestigt het pathogene karakter van deze mutatie. Massaspectrometrische analyse van controle en morphant embryos heeft aangetoond dat tmem165 noodzakelijk is voor een goede verwerking van N-glycanen in de zebravis. Dit resultaat is consistent met het CDG fenotype waargenomen bij de patiënten.
Tot slot tonen we met deze studie de impact van tmem165 deficiëntie op de ontwikkeling in de zebravis aan. Bovendien is dit het eerste diermodel voor dit nieuwe type CDG. Onze analyse van tmem165 morphant embryos toont aan dat een deficiëntie in tmem165 in de zebravis leidt tot een verandering in N-glycosylering en tot kraakbeenletsels. Zowel de morfologische als de biochemische kenmerken die in de zebravis werden geobserveerd, weerspiegelen het fenotype bij de patiënten. Dit bevestigt ook ook ondubbelzinnig het causaal verband tussen de TMEM165 deficiëntie en de ziekte.
Datum:1 okt 2009  →  25 jun 2014
Trefwoorden:glycosylation
Disciplines:Genetica, Systeembiologie, Moleculaire en celbiologie, Medische beeldvorming en therapie, Andere paramedische wetenschappen
Project type:PhD project