< Terug naar vorige pagina

Project

In vitro reconstitutie van eiwitsecretie doorheen het Type 3 systeem

Eiwitten moeten, om correct te werken, hun finale subcellulaire bestemmingen bereiken en hun finale 3D structuur aannemen. Daarom zijn het targeting en transport van eiwitten essentieel cellulair processen in alle levensrijken. Begrijpen hoe eiwitten worden getransporteerd en gevouwen worden tot een functioneel eiwit, onthult de fundamentele aspecten van cellulaire eiwitbiologie, zoals celwandbiogenese, celdeling, moleculaire-export/opname/afbraak enz. Bovendien helpt deze basiskennis ziekten aanpakken die worden veroorzaakt door vouwstoornissen en microbiële infecties waarbij uitgescheiden toxines vaak hoofdrolspelers zijn.

Cellen hebben gespecialiseerde machines ontwikkeld om eiwitexport te bemiddelen. Toch blijven de exacte exportmechanismen van veel van deze verschillende exportsystemen onduidelijk. Deze kennis is vereist voor de succesvolle ontwikkeling van geneesmiddelen die op deze processen werken.

In dit proefschrift concentreerde ik me op twee hoofdaspecten van eiwitexport. Ten eerste wilde ik de fysisch-chemische eigenschappen bestuderen van bacteriële eiwitten die worden uitgescheiden in vergelijking met die van cytoplasmatische eigenschappen om de structurele kenmerken te definiëren die gepaard gaan met het secretievermogen van polypeptiden. Ten tweede, bestudeerde ik een complex eiwitexportsysteem in pathogene bacteriën, het type III-secretiesysteem (T3SS), om het exportmechanisme ervan te begrijpen en hoe het kan worden geremd.

Om het proteoom te karakteriseren en de verschillende subcellulaire topologiegroepen te vergelijken, hebben we alle eiwitten in het E. coli K-12 modelorganisme en hun fysisch-chemische eigenschappen verzameld en bestudeerd. Door proteoom analyse uit te voeren, hebben we de eigenschappen van de cytoplasmatische eiwitten gedefinieerd en vergeleken met de gesecreteerde eiwitten. We ontdekten dat uitgescheiden eiwitten verbeterde flexibiliteit, langzaam vouwen, lossere structuren en unieke vouwen vertonen die hen onderscheiden van het cytoplasmoom. Deze aanpassingen beschermen het secretoom tegen vroegtijdige vouwing voordat het de uiteindelijke bestemming bereikt, optimaliseren het transport en hebben implicaties voor de specifieke functies van elke eiwitgroep. Deze bevindingen hebben brede implicaties voor de structurele diversiteit in verschillende celcompartimenten en het eiwitvouwingsprobleem en suggereren hoe de evolutie van moderne proteomen mogelijk heeft plaatsgevonden. Voor zover wij weten, is dit de eerste uitgebreide curatie en analyse van de structurele kenmerken van subcellulaire eigenschappen van de topologiegroep van het modelorganisme E. coli K-12. De verzamelde gegevens zijn publiekelijk beschikbaar in onze onlinedatabase STEPdb. Om onze bevindingen en hypothesen verder te versterken, is experimenteel bewijs nodig en dit is de toekomstige richting in ons laboratorium.

T3SS is een pathogene transportroute die virulentie-eiwitten van het bacteriële cytoplasma naar het eukaryote cytoplasma aflevert via een complexe membraanspannende structuur, het injectisoom. Om de moleculaire mechanismen van de T3-secretie op te begrijpen, hebben we voor het eerst in vitro assays vastgesteld. Deze aanpak maakte het mogelijk het exportsysteem te ontleden in mechanistische stappen die afzonderlijk kunnen worden bestudeerd. Eerst streefden we ernaar om inzicht te krijgen in de targetingstap en bleek de belangrijkste export-apparaatcomponent EscV/SctV de belangrijkste receptor op het membraan te zijn. Bovendien verhoogt de gatekeeper SepL/SctW die eraan is gebonden de affiniteit van de middelste substraten tot het injectiosoom. Na de afscheidingsschakelaar verlaat de gatekeeper het injectiesysteem via een onbekend mechanisme, waardoor de affiniteit van de late substraten voor het exportapparaat toeneemt. Bovendien zijn we begonnen met het reconstitueren van opeenvolgende stappen van de injectie assemblage. Deze inspanningen zullen in de toekomst worden voortgezet. Een beter begrip van de T3SS opent een mogelijkheid om remmers van dit proces te ontwikkelen en zo de virulentie van pathogene bacteriën te verminderen.

Samengevat, beschrijf ik in dit proefschrift het onderzoek dat ik heb uitgevoerd of waaraan ik heb bijgedragen om de fundamentele aspecten van targeting en de secretie in de Gram-negatieve bacteriën, E. coli en enteropathogene E. coli, te begrijpen. Ten eerste, hebben we geconcludeerd dat verschillende topologiegroepen zoals cytoplasmatische en gesecreteerde eiwitten verschillend zijn, met opvallende fysicochemische en structurele verschillen in E. coli K-12-stam. Daarnaast hebben we bestudeerd hoe eiwitten getargeted worden voor de secretie door membranen met T3SS in pathogene E. coli-stam en het samenspel van verschillende injectisomecomponenten die dit proces ondersteunen. We willen deze kennis en technieken gebruiken om kleine moleculeremmers te zoeken en te ontwikkelen om de bacteriële infecties te bestrijden.

Datum:1 aug 2015 →  24 sep 2019
Trefwoorden:Protein secretion, Cytoplasmome, Protein Disorder, Protein Domains, Protein folding, Protein subcellular localization, Protein targeting, Secretome, T3SS, injectisome, Type III Secretion System, E. coli, Enteropathogenic E. coli, In vitro reconstitution
Disciplines:Microbiologie, Systeembiologie, Laboratoriumgeneeskunde, Engineering van biomaterialen, Biologische systeemtechnologie, Biomateriaal engineering, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Milieu ingenieurswetenschappen en biotechnologie, Industriële biotechnologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen, Immunologie
Project type:PhD project