Visualisatie van biomoleculaire interacties en sensing in levende systemen met superresolutie-fluorescentiemicroscopie.

Fluorescentiemicroscopie is een krachtige techniek om levende systemen te bestuderen met een goed ruimtelijke en tijdsresolutie. Helaas is de ruimtelijke resolutie van een conventionele microscoop beperkt door diffractie, zodat de rechtstreekse visualisatie van biologische processen op hun zeer klein schaal beperkt is. In het laatste decennium werden meerdere superresolutie-fluorescentiemicroscopietechnieken ontwikkeld, die deze diffractielimiet doorbreken en een nieuwe revolutionaire kijk bieden op structuren van 100 nm en kleiner. Één van deze methodes, pcSOFI, maakt gebruik van een statistische analyse van knipperende fluoroforen om subdiffractie-informatie te bekomen.

De noodzakelijke flikkering voor pcSOFI wordt het meest eenvoudig bekomen door gebruik te maken van reversibel fotoschakelbare fluorescente eiwitten (RSFPs). Dit zijn varianten van het groen fluorescent eiwit (GFP), dat reeds in 1962 werd ontdekt. De speciale eigenschap van deze genetisch gecodeerde fluoroforen is hun capaciteit om reversibel te schakelen tussen een fluorescente en niet-fluorescente toestand, door ze met licht van een bepaalde golflengte te bestralen. Constant fluctueren tussen beide toestanden resulteert in flikkering die geschikt is voor pcSOFI analyse.

Omdat “fotofysisch slimme probes”, zoals RSFPs, een zeer belangrijke rol spelen in superresolutiemicroscopie, wordt de prestatie van deze technieken vaak bepaald door de kwaliteit van de gebruikte fluoroforen. De ontwikkeling van geoptimaliseerde varianten is dus een cruciale stap om het volledige potentieel van subdiffractie-microscopie te behalen.

In deze thesis beschrijf ik de basisprincipes om verbeterde fluorescente eiwitten te maken en te bestuderen, en pas ik deze principes toe op RSFPs. In Hoofdstuk 2 beschrijf ik een reeks mutanten gebaseerd op Dronpa en Dronpa2, een traag en een snel fotoschakelbaar eiwit. Door structurele varianten te maken en te verbeteren, effende ik het pad voor de ontwikkeling van refSOFI. Deze complementatie-gebaseerde methode laat toe om eiwit-eiwit interacties te visualiseren met superresolutie. Ik toon verder aan hoe andere varianten van Dronpa en Dronpa2 verhoogde fluorescentie tonen, wanneer ze tot expressie gebracht worden op 37°C, en hun efficiënt fotoschakelgedrag behouden.

In Hoofdstuk 3 introduceer ik de rsGreens. Deze RSFPs werden ontwikkeld met een methode die zeer geschikt is voor het optimaliseren van “slimme” fluorescente eiwitten. De spectroscopische, fotochrome en biologische eigenschappen van de rsGreens werden ook grondig gekarakteriseerd. Het werk op de rsGreens werd verdergezet in Hoofdstuk 4. In dit hoofdstuk beschrijf ik de structurele analyse van rsGreen0.7 en de lessen die dit opleverde in verband met de biologische en fotoschakel-capaciteiten. Deze informatie pas ik vervolgens toe op de gerichte ontwikkeling van nieuwe rsGreen varianten met variabele fotochrome eigenschappen.

Het laatste hoofdstuk met resultaten, Hoofdstuk 5, geeft een uitgebreide beschrijving van pcSOFI en beschrijft een gedetailleerde analyse van de prestaties van pcSOFI in verschillende omstandigheden. Ik rapporteer ook de eerste resultaten bekomen met multi-tau (mt) pcSOFI. Deze methode laat toe om meerdere spectroscopisch identieke fluoroforen te scheiden op basis van hun flikkergedrag.

De ontwikkeling van een groot aantal nieuwe RSFPs met voordelige biologische en fotochrome eigenschappen voorziet ons van een grote waaier aan “slimme probes”. De grondige karakterisatie van de ontwikkelde eiwitten leidt tot een beter begrip van de verschillende onderliggende mechanismen, wat een voordeel kan bieden bij volgende optimalisatiepogingen. Door het pad te effenen voor refSOFI, het potentieel van mt-pcSOFI aan te tonen en de prestaties van pcSOFI te kwantificeren hoop ik bijgedragen te hebben tot de toepassingsmogelijkheden van pcSOFI en superresolutiemicroscopie in het algemeen.