Het ontrafelen van de verdedigingsmechanismen van bosaardbeivruchten en -bladeren tegen Botrytis cinerea

Aardbeien groeien in meer dan 70 landen en zijn wereldwijd een economisch belangrijk zacht fruit. Aardbeien worden door de consument zeer gewaardeerd om hun voedingswaarde, zachte textuur en zoete smaak. Deze kenmerken zijn echter ook gunstig voor schimmelpathogenen, met name Botrytis cinerea. Deze necrotrofe ziekteverwekker kan grauwe schimmel veroorzaken met enorme economische en productieverliezen tot gevolg. Momenteel wordt de ziekte hoofdzakelijk bestreden door toepassing van fungiciden. Deze kunnen echter schadelijk zijn voor het milieu en bovendien ontwikkelt B. cinerea gemakkelijk resistentie tegen fungiciden. Daarom is er dringend behoefte aan alternatieve beheersingsstrategieën, zoals bijvoorbeeld de implementatie van resistente cultivars, de vroegtijdige opsporing van B. cinerea en het gebruik van biocontrolemiddelen die de conventionele gewasbeschermingsmiddelen kunnen aanvullen. Om dit te bereiken, is een beter inzicht nodig in hoe aardbeien zich verdedigen tegen B. cinerea.

Dit doctoraatsonderzoek heeft tot doel meer basiskennis te verkrijgen over de interactie tussen vruchten en bladeren van aardbei en B. cinerea. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een brede waaier aan technologieën waaronder een transcriptoomanalyse met behulp van RNA sequencing (RNA-seq), metingen van vluchtige organische stoffen (volatile organic compounds; VOCs) met behulp van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) en selected ion flow tube massaspectrometrie (SIFT-MS) en biochemische analyses. We kozen ervoor deze studie uit te voeren op de bosaardbei Fragaria vesca omwille van haar korte levenscyclus, terugkerende bloei en de beschikbaarheid van een moleculaire toolbox.

Infectie van aardbeivruchten gebeurt meestal via de bloemen, waarna de schimmel latent aanwezig blijft in de onrijpe vrucht en de infectie pas in de rijpe vrucht leidt tot ziektesymptomen. Om dit natuurlijke infectieproces te bestuderen, inoculeerden we aardbeibloemen met B. cinerea en verzamelden we stalen tijdens verschillende ontwikkelings- en rijpingsstadia (bloem, onrijpe vrucht en rijpe vrucht). RNA-seq en GC-MS werden vervolgens gebruikt om de moleculaire respons in aardbei te onderzoeken en om de veranderingen van de vluchtige organische stoffen VOCs op te volgen. Genen die coderen voor proteïnen betrokken bij de herkenning van pathogeen, de versterking en afbraak van de celwand, de regulatie van hormonen, alsook de accumulatie van reactieve zuurstofverbindingen (reactive oxygen species, ROS), gespecialiseerde metabolieten en antimicrobiële proteïnen, kwamen verschillend tot expressie. De productie van VOC's, voornamelijk behorend tot de terpeen-, alcohol- en aldehydeklassen, werden ook significant beïnvloed door inoculatie met B. cinerea. De sterkste afweerreacties werden gevonden in rijpe vruchten, terwijl de afweer-gerelateerde genen overwegend werden downgereguleerd in onrijpe vruchten, wat erop wijst dat de geïnduceerde afweerreactie niet de belangrijkste reden is voor het beperken van de groei van B. cinerea in onrijpe vruchten. In de controleconditie (afwezigheid van B. cinerea inoculatie) was de expressie van afweerrespons-gerelateerde genen en de concentratie aan VOC's met gerapporteerde antimicrobiële activiteit hoger in de onrijpe vruchten in vergelijking met de rijpe vruchten. Bovendien bleven de gecombineerde geïnduceerde en constitutieve verdedigingsmechanismen in rijpe vruchten lager dan de voorgevormde verdedigingsmechanismen in onrijpe vruchten, wat suggereert dat de constitutieve verdediging in onrijpe vruchten in belangrijke mate bijdraagt tot de resistentie tegen B. cinerea. Door de transcriptoomresponsen van onrijpe en rijpe vruchten na bloei-inoculatie in onze studie te vergelijken met directe inoculatie van onrijpe en rijpe vruchten uit een eerdere studie, vonden we dat aardbei verschillend reageert op verschillende inoculatiemethoden. Bovendien werden 34 genen significant ge-upreguleerd gevonden in andere aardbeien-pathosystemen, behalve in fruit na bloeminoculatie met B. cinerea: fruit-B. cinerea, bladeren-Podosphaera aphanis, bladeren-B. cinerea en wortel-Phytophthora cactorum. Deze 34 genen reageerden op een pathogene aanval onafhankelijk van de levenswijze van de pathogeen of het geïnfecteerde plantenweefsel, en spelen mogelijk een belangrijke rol tegen deze pathogenen. Breed-spectrum resistentie verwijst naar resistentie tegen twee of meer soorten pathogenen. B. cinerea is een necrotrofe schimmel, P. aphanis is een biotrofe schimmel en P. cactorum is een oomycete; daarom dragen deze 34 genen potentieel bij tot de breedspectrumziekteweerstand in F. vesca.

Aangezien B. cinerea aardbeien meestal infecteert via hun bloemen, treden de symptomen op wanneer de vruchten volledig rijp zijn. Daarom is een snelle en gevoelige methode nodig om de schimmelinfectie op te sporen en te kwantificeren vóór de ontwikkeling van de symptomen. In ons onderzoek werden ook bloemen geïnoculeerd en werden vruchten in verschillende ontwikkelingsstadia verzameld. We merkten op dat kwantitatieve polymerasekettingreactie (quantitative polymerase chain reaction; qPCR) vals-negatieve resultaten gaf wanneer de hoeveelheid B. cinerea DNA in aardbeien laag was (d.w.z. <0.01 ng). De combinatie van SIFT-MS met multivariate statistiek identificeerde vijf potentiële biomerkers in aardbei na infectie met B. cinerea en leidde tot een nauwkeuriger onderscheid tussen stalen die verschillende hoeveelheden B. cinerea bevatten. Na verdere optimalisatie kan SIFT-MS in de toekomst worden aanbevolen als een potentiële alternatieve methode om B. cinerea op te sporen alvorens symptomen zich ontwikkelen.

Constitutieve verdedigingsmechanismen blijken ook zeer belangrijk te zijn in bladeren van bosaardbei wanneer een gevoelig genotype (F. vesca ssp. vesca Tenno 3; T3) vergeleken werd met een matig resistent genotype (F. vesca ssp. vesca Kreuzkogel 1; K1). Meer specifiek stellen we voor dat K1 bladeren resistenter zijn tegen B. cinerea in vergelijking met T3 bladeren door een lagere hoeveelheid aan H2O2, wat werd toegeschreven aan hogere gehaltes aan antioxidanten en antioxidant enzymen in K1. De hoeveelheid H2O2 vertoonde immers een negatieve correlatie met de resistentie van aardbei tegen B. cinerea, terwijl de totale hoeveelheid aan flavonoïden en fenolen positief correleerde met de resistentie. Bovendien bevestigden we de negatieve correlatie tussen H2O2 en plantresistentie door gebruik te maken van 50 genotypes met een verschillend resistentieniveau tegen B. cinerea.

Aardbeibladeren worden steeds vaker gebruikt om de gevoeligheid van aardbeien en hun afweermechanismen tegen pathogenen te evalueren, aangezien de gevoeligheid van vruchten sterk beïnvloed wordt door het rijpingsstadium. Door gebruik te maken van 127 F. vesca genotypes vonden we echter een zeer zwakke correlatie tussen de niveaus van blad- en vruchtresistentie tegen B. cinerea (R = 0,19; P = 0,03), waardoor bladresistentie niet gebruikt kan worden om de vruchtresistentie tegen B. cinerea te evalueren. Tijdens dit onderzoek vonden we ook twee genotypes (AU1 en FIN25) die resistentie vertoonden tegen B. cinerea op zowel bladeren als vruchten. Ten slotte werd na het evalueren van het resistentieniveau van 213 F. vesca genotypes een latitudinale gradiënt in de resistentie tegen B. cinerea in aardbeibladeren gevonden, met een afnemende resistentie voor de genotypes afkomstig van een lage naar een hoge breedtegraad.

Samengevat, (1) bevestigde deze studie het belang van de constitutieve afweer in zowel aardbeibladeren als -vruchten, (2) toonden we aan dat de hoeveelheid H2O2 de resistentie van aardbeibladeren tegen B. cinerea significant beïnvloedt, (3) identificeerden we 34 genen die mogelijk bijdragen tot breedspectrum ziekteresistentie in F. vesca, (4) identificeerden we VOCs die mogelijk in de toekomst als biocontrole-agentia kunnen gebruikt worden, (5) identificeerden we twee F. vesca-genotypes die resistent zijn tegen B. cinerea, en (6) stelden we een potentiële alternatieve benadering voor (SIFT-MS) bij het opsporen van B. cinerea tijdens de latent infectie.