< Terug naar vorige pagina

Project

VALIDATIE EN IDENTIFICATIE VAN EIWIT-GENEESMIDDEL INTERACTIES MET BEHULP VAN CRISPR/CAS-GEMEDIËERDE MUTAGENESE

De ontdekking en ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen vormen een belangrijke taak van de farmaceutische industrie. Dit proces is zwaar, tijdrovend en kostelijk en veel nieuwe medicijnen geraken niet door de klinische ontwikkelingsfasen omdat ze onvoldoende activiteit vertonen. Een belangrijke oorzaak voor dit falen wordt gezien als onvoldoende bevestiging van het doelwit en werkingsmechanisme van het kandidaat medicijn. Hierdoor is het ontrafelen van het doelwit en werkingsmechanisme van een medicijn een belangrijke stap in het ontwikkelingstraject van een nieuw medicijn. Er zijn verschillende methoden voor de ontrafeling van het doelwit van een medicijn, maar geen enkele biedt een algemeen toepasbare oplossing. Niettegenstaande bieden genetische methoden een sterk platform voor doelwitidentificatie omdat zij toelaten interacties tussen medicijnen en doelwitten in een cellulaire context te bestuderen. Met de ontwikkeling van “next generation sequencing”, RNA-interferentie en recentelijk CRISPR/Cas-gemedieerde genoommodificatie, is het immers mogelijk geworden om genetische methoden op grote schaal toe te passen in menselijke cellen. Sommige van deze methoden kampen echter met technische problemen, of kunnen niet gebruikt worden om essentiële genen te onderzoeken, terwijl weer andere dure sequencing gekoppeld aan complexe bioinformatica vereisen. Hierdoor heeft het veld nood aan alternatieven die toelaten het doelwit en werkingsmechanisme van een nieuw medicijn makkelijk en goedkoop te identificeren. In deze thesis onderzoeken wij of CRISPR/Cas-gemedieerde genoommodificatie een meerwaarde kan bieden voor de validatie en identificatie van interacties tussen doelwitten en kandidaat medicijnen in een menselijke context.

In het eerste deel valideren wij de interactie van klein molecule kandidaat geneesmiddelen met exportine-1 (XPO1). XPO1 is een essentieel eiwit en faciliteert het actieve transport van eiwitten vanuit de celkern naar het cytoplasma. Deze eiwitten omvatten onder andere transcriptiefactoren, tumorsuppressoren en groei-regulatorische eiwitten. Een correct nucleair-cytoplasmatisch transport is dus essentieel om de cellulaire homeostase te bewaren. De XPO1 inhibitoren vertonen een sterke anti-kankeractiviteit in verschillende laboratorium- en dierproeven en worden momenteel onderzocht in klinische studies tegen kanker. Verder is aangetoond dat deze geneesmiddelen de functie van het cellulaire XPO1 eiwit verhinderen door covalent te binden op het cysteine528 residu van XPO1. Nu was het niet bewezen dat de anti-kankeractiviteit van de XPO1 inhibitoren veroorzaakt wordt door verstoring van de XPO1 functie. Om dit te bewijzen pasten wij CRISPR/Cas-gemedieerde genoommodificatie toe om in kanker cellijnen het cysteine528 residu in XPO1 te vervangen door een serine. Deze mutante cellijnen waren zeer ongevoelig aan de XPO1 inhibitoren, wat bewijst dat de anti-kankeractiviteit van deze middelen afhankelijk is van het cysteine528 residu in XPO1.

In het tweede deel ontwikkelen wij een nieuwe genetische methode om het cellulaire doelwit van een kandidaat geneesmiddel te identificeren via CRISPR/Cas-gemedieerde mutagenese. Wij redeneerden dat CRISPR/Cas-gemedieerde DNA-dubbelstrengbreuken het mogelijk maken om doelgerichte “gain-of-function” resistentie mutaties te bekomen in essentiële genen. Om dit concept te valideren pasten wij CRISPR/Cas-gemedieerde genoommodificatie toe op drie anti-kankermedicijnen waarvan het cellulaire doelwit gekend is. Na deze validatie pasten wij dit concept op grote schaal toe waarbij meerdere genen tegelijk afgetast werden op resistentiemutaties om nicotinamide-fosforibosyltransferase (NAMPT) als het cellulaire doelwit van een kandidaat geneesmiddel te identificeren. Deze bevinding werd verder gevalideerd via X-stralen kristallografie en CRISPR/Cas-gemedieerde genoommodificatie. Daarnaast toonden wij ook aan dat de methode compatibel is met het klasse 2 type 5 AsCpf1 CRISPR endonuclease. Samen laten onze resultaten zien dat CRISPR/Cas-gemedieerde genoommodificatie een krachtig hulpmiddel biedt voor de validatie en identificatie van interacties tussen medicijnen en hun doelwit.

Datum:1 okt 2013 →  27 apr 2018
Trefwoorden:Drug resistance, Target identification, CRISPR/Cas genome editing, Anti-cancer therapeutics
Disciplines:Andere biologische wetenschappen, Morfologische wetenschappen, Oncologie, Engineering van biomaterialen, Biologische systeemtechnologie, Biomateriaal engineering, Biomechanische ingenieurswetenschappen, Andere (bio)medische ingenieurswetenschappen, Milieu ingenieurswetenschappen en biotechnologie, Industriële biotechnologie, Andere biotechnologie, bio-en biosysteem ingenieurswetenschappen
Project type:PhD project