Trombotische trombocytopenische purpura: van geletterdheid bij patiënten tot identificatie van immuunprofielen

Trombotische trombocytopenische purpura (TTP) is een vorm van trombotische microangiopathie die gekarakteriseerd wordt door een ernstige deficiëntie van ADAMTS13 (‘A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin type 1 repeats, member 13’). Deze deficiëntie kan te wijten zijn aan mutaties in het ADAMTS13-gen (congenitale TTP; cTTP) of aan autoantilichamen die gericht zijn tegen ADAMTS13 (immuun-gemedieerde TTP; iTTP). Het ADAMTS13 enzym heeft als functie om de heel lange von Willebrand factor (‘Ultra-Large’ VWF, UL-VWF) multimeren te knippen in kleinere, minder pro-trombotische, multimeren. Dit proces voorkomt de spontane interactie tussen UL-VWF en bloedplaatjes. Wanneer ADAMTS13 afwezig of inactief is, zullen UL-VWF multimeren accumuleren tot bloedplaatjes-rijke microtrombi, die verspreid in de bloedbaan arteriolen en haarvaten blokkeren. Deze systemische microvasculaire trombose kan resulteren in orgaanfalen en kan levensbedreigend worden met een mortaliteit van 90% indien behandeling ontbreekt. Spoedige diagnose en hierop volgende behandeling verlagen de sterftegraad naar 20%. Patiënten die een acute episode overleven, lopen nog steeds risico op terugkerende acute episodes. Daarom proberen zowel artsen als onderzoekers meer inzicht te krijgen in de pathofysiologie van deze ziekte, zodat die bevindingen kunnen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe strategieën om TTP te voorkomen, diagnosticeren en te behandelen.

TTP is een zeldzame aandoening, waarbij het klinische vermoeden van de ziekte bevestigd wordt door een ADAMTS13 activiteit van minder dan 10%. De zeldzaamheid van TTP, samen met de inherente vertraging op de resultaten van de test voor ADAMTS13 activiteit, leidt tot een initiële foute diagnose in 20% van de TTP-patiënten. Deze foutieve diagnose van TTP door zorgverleners, suggereert dat kennis over het bestaan van deze ziekte verbeterd moet worden en dit niet alleen bij professionele zorgverleners maar ook bij TTP-patiënten. Goed geïnformeerde patiënten halen meer uit hun zorgervaring, met verminderde complicaties, morbiditeit en mortaliteit tot gevolg. Zo is al aangetoond dat educatief materiaal aangeboden door patiëntenorganisaties voordelige effecten heeft op de behandeling van de patiënten. Momenteel is nog niet duidelijk hoeveel de patiënten begrijpen over TTP en welke factoren invloed hebben op hun begrip. Daarom hebben we de ‘TTP-geletterdheid’ in TTP-patiënten geanalyseerd en onderzocht welke factoren geassocieerd worden met een verminderd ziektebegrip (Doelstelling I). Door middel van een enquête werd duidelijk dat de patiënten al een substantiële kennis over de ziekte hebben maar dat er toch nog significante hiaten zijn in deze kennis. Deze tekorten aan kennis zijn gerelateerd aan het ontstaan van de ziekte, het belang van behandeling, factoren van aanleg voor TTP en stappen te ondernemen bij een noodgeval. Daarnaast werd gevonden dat ziektebegrip beïnvloed wordt door leeftijd en opleidingsniveau.

De continue ontwikkeling van methodologieën en de beschikbaarheid van biologische reagentia worden gebruikt om de kennis rond ADAMTS13 en TTP te vergroten. Zo hebben studies met fragmenten van, of variaties op, ADAMTS13 in immunoassays (zoals immunoprecipitatie, ELISA en Western Blot) aangetoond dat patiënten met iTTP een polyclonale immuunrespons vertonen, met voornamelijk antilichamen gericht tegen het spacer-domein van ADAMTS13. Kleine cohortstudies in acute iTTP patiënten hebben aangetoond dat de residuen R568F592R660Y661Y665 de voornaamste bindingsplaats zijn voor anti-spacer antilichamen. Hierdoor zijn actieve ADAMTS13 varianten ontwikkeld die een verminderde binding vertonen aan anti-ADAMTS13 antilichamen. Ook andere regio’s in het spacer-domein kunnen het doelwit zijn van anti-spacer antilichamen. Net daarom zijn grote cohortstudies nodig om meer inzicht te krijgen in de immunogene regio’s van het spacer-domein. Dit zal daarnaast ook bijdragen tot de identificatie van patiënten die baat zouden hebben bij het gebruik van therapieën op basis van ADAMTS13 spacer-varianten. Deze studies zouden daarnaast ook toelaten om mogelijke verbanden tussen het anti-spacer antilichamen profiel en de ernst van de ziekte te onderzoeken. Daarom hebben we een ELISA ontwikkeld en gevalideerd die gebruik maakt van ADAMTS13/ADAMTS1 hybriden, waarin regio’s van het ADAMTS13 spacer-domein vervangen werden door de corresponderende regio’s in ADAMTS1. Hierdoor konden we de epitopen van anti-spacer antilichamen van een grote cohorte aan TTP-patiënten, met acute ziekte of in remissiefase, in kaart brengen (Doelstelling II). Zo vonden we dat aminozuur regio’s 588-592, 602-610 en 657-666 hotspots zijn voor het binden van anti-spacer antilichamen. Afhankelijk van de patiënt werden daarnaast nog andere regio’s binnen en buiten het spacer-domein gevonden die herkend werden door anti-ADAMTS13 antilichamen. Er werden geen grote veranderingen in de profilen van anti-spacer antilichamen gevonden gedurende het ziekteverloop. Tot slot was de ernst van de ziekte niet gelinkt aan een bepaald antilichaamprofiel.

Antilichamen zijn essentiële hulpmiddelen gebleken om de pathofysiologie van TTP in vitro te onderzoeken en om dierenmodellen voor TTP te ontwikkelen. Het Laboratorium voor Trombose Onderzoek is gespecialiseerd in de ontwikkeling van monoclonale anti-humane ADAMTS13 antilichamen, die hebben geleid tot nieuwe inzichten in de structuur van ADAMTS13, het werkingsmechanisme van ADAMTS13 en de ADAMTS13 antigenen in patiënten. Ondanks hun hoge specificiteit, zijn monoclonale antilichamen gevoelig voor veranderingen in de epitoop of epitopen in het antigen, wat ook het gebruik in immunoassays gaat limiteren. Polyclonale antilichamen zullen daarentegen, verschillende epitopen van hetzelfde antigeen herkennen, waardoor ze minder vatbaar zijn voor veranderingen in het antigeen. Op deze manier hebben we in deze studie een polyclonaal anti-humaan ADAMTS13 antilichaam ontwikkeld met hoge specificiteit en gevoeligheid, en gevalideerd voor gebruik in immunoassays als ELISA, Western Blot en immunocytochemie (Doelstelling III). Tot slot worden dierenmodellen in TTP gebruikt om de pathofysiologische mechanismen onderliggend aan TTP te ontrafelen en om nieuwe therapeutische middelen te ontwikkelen. Daarom werden reagentia die specifiek kruisreageerden met ADAMTS13 van muizen ontwikkeld. In deze studie werd een antigeengebaseerde opzuivering van een eerder ontwikkeld polyclonaal anti-muis ADAMTS13 antibody, uitgevoerd (Doelstelling III). Dit proces verhoogde de zuiverheid van het antilichaam en zorgde voor een verrijking van de specifieke anti-muis ADAMTS13 antilichamen.

Dit doctoraat onderzocht de TTP-geletterdheid van patiënten en toonde aan dat toegenome leeftijd en een lagere opleidingsgraad geassocieerd zijn met laag ziektebegrip. Het blijkt dat niet alle patiënten zich bewust zijn van de oorsprong van de ziekte, het belang van de behandeling, de predisponerende factoren die een acute TTP-episode uitlokken en welke acties ondernomen moeten worden in een noodsituatie. Daarnaast werd een ELISA ontwikkeld om de epitopen van anti-spacer antilichamen in TTP-patiënten in kaart te brengen, hiermee werd aangetoond dat het spacer-domein drie hotspot regio’s voor antilichaambinding bevat. De bevindingen uit deze studie kunnen helpen in het ontwerpen van nieuwe therapieën met als doel om actief ADAMTS13, die aan de immuunrespons kan ontsnappen, te voorzien. Daarnaast toonden we aan dat de immuunrespons tegen het spacer-domein niet veranderde tijdens het ziekteverloop. Tot slot werd een polyclonaal anti-humaan ADAMTS13 antilichaam ontwikkeld, terwijl een antigeengebaseerde affiniteits-opzuivering van het polyclonale anti-muis ADAMTS13 antilichaam de specifieke anti-muis ADAMTS13 antilichamen aanrijkte.

Trombotische trombocytopenische purpura (TTP) is een vorm van trombotische microangiopathie die gekarakteriseerd wordt door een ernstige deficiëntie van ADAMTS13 (‘A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin type 1 repeats, member 13’). Deze deficiëntie kan te wijten zijn aan mutaties in het ADAMTS13-gen (congenitale TTP; cTTP) of aan autoantilichamen die gericht zijn tegen ADAMTS13 (immuun-gemedieerde TTP; iTTP). Het ADAMTS13 enzym heeft als functie om de heel lange von Willebrand factor (‘Ultra-Large’ VWF, UL-VWF) multimeren te knippen in kleinere, minder pro-trombotische, multimeren. Dit proces voorkomt de spontane interactie tussen UL-VWF en bloedplaatjes. Wanneer ADAMTS13 afwezig of inactief is, zullen UL-VWF multimeren accumuleren tot bloedplaatjes-rijke microtrombi, die verspreid in de bloedbaan arteriolen en haarvaten blokkeren. Deze systemische microvasculaire trombose kan resulteren in orgaanfalen en kan levensbedreigend worden met een mortaliteit van 90% indien behandeling ontbreekt. Spoedige diagnose en hierop volgende behandeling verlagen de sterftegraad naar 20%. Patiënten die een acute episode overleven, lopen nog steeds risico op terugkerende acute episodes. Daarom proberen zowel artsen als onderzoekers meer inzicht te krijgen in de pathofysiologie van deze ziekte, zodat die bevindingen kunnen leiden tot de ontwikkeling van nieuwe strategieën om TTP te voorkomen, diagnosticeren en te behandelen.

TTP is een zeldzame aandoening, waarbij het klinische vermoeden van de ziekte bevestigd wordt door een ADAMTS13 activiteit van minder dan 10%. De zeldzaamheid van TTP, samen met de inherente vertraging op de resultaten van de test voor ADAMTS13 activiteit, leidt tot een initiële foute diagnose in 20% van de TTP-patiënten. Deze foutieve diagnose van TTP door zorgverleners, suggereert dat kennis over het bestaan van deze ziekte verbeterd moet worden en dit niet alleen bij professionele zorgverleners maar ook bij TTP-patiënten. Goed geïnformeerde patiënten halen meer uit hun zorgervaring, met verminderde complicaties, morbiditeit en mortaliteit tot gevolg. Zo is al aangetoond dat educatief materiaal aangeboden door patiëntenorganisaties voordelige effecten heeft op de behandeling van de patiënten. Momenteel is nog niet duidelijk hoeveel de patiënten begrijpen over TTP en welke factoren invloed hebben op hun begrip. Daarom hebben we de ‘TTP-geletterdheid’ in TTP-patiënten geanalyseerd en onderzocht welke factoren geassocieerd worden met een verminderd ziektebegrip (Doelstelling I). Door middel van een enquête werd duidelijk dat de patiënten al een substantiële kennis over de ziekte hebben maar dat er toch nog significante hiaten zijn in deze kennis. Deze tekorten aan kennis zijn gerelateerd aan het ontstaan van de ziekte, het belang van behandeling, factoren van aanleg voor TTP en stappen te ondernemen bij een noodgeval. Daarnaast werd gevonden dat ziektebegrip beïnvloed wordt door leeftijd en opleidingsniveau.

De continue ontwikkeling van methodologieën en de beschikbaarheid van biologische reagentia worden gebruikt om de kennis rond ADAMTS13 en TTP te vergroten. Zo hebben studies met fragmenten van, of variaties op, ADAMTS13 in immunoassays (zoals immunoprecipitatie, ELISA en Western Blot) aangetoond dat patiënten met iTTP een polyclonale immuunrespons vertonen, met voornamelijk antilichamen gericht tegen het spacer-domein van ADAMTS13. Kleine cohortstudies in acute iTTP patiënten hebben aangetoond dat de residuen R568F592R660Y661Y665 de voornaamste bindingsplaats zijn voor anti-spacer antilichamen. Hierdoor zijn actieve ADAMTS13 varianten ontwikkeld die een verminderde binding vertonen aan anti-ADAMTS13 antilichamen. Ook andere regio’s in het spacer-domein kunnen het doelwit zijn van anti-spacer antilichamen. Net daarom zijn grote cohortstudies nodig om meer inzicht te krijgen in de immunogene regio’s van het spacer-domein. Dit zal daarnaast ook bijdragen tot de identificatie van patiënten die baat zouden hebben bij het gebruik van therapieën op basis van ADAMTS13 spacer-varianten. Deze studies zouden daarnaast ook toelaten om mogelijke verbanden tussen het anti-spacer antilichamen profiel en de ernst van de ziekte te onderzoeken. Daarom hebben we een ELISA ontwikkeld en gevalideerd die gebruik maakt van ADAMTS13/ADAMTS1 hybriden, waarin regio’s van het ADAMTS13 spacer-domein vervangen werden door de corresponderende regio’s in ADAMTS1. Hierdoor konden we de epitopen van anti-spacer antilichamen van een grote cohorte aan TTP-patiënten, met acute ziekte of in remissiefase, in kaart brengen (Doelstelling II). Zo vonden we dat aminozuur regio’s 588-592, 602-610 en 657-666 hotspots zijn voor het binden van anti-spacer antilichamen. Afhankelijk van de patiënt werden daarnaast nog andere regio’s binnen en buiten het spacer-domein gevonden die herkend werden door anti-ADAMTS13 antilichamen. Er werden geen grote veranderingen in de profilen van anti-spacer antilichamen gevonden gedurende het ziekteverloop. Tot slot was de ernst van de ziekte niet gelinkt aan een bepaald antilichaamprofiel.

Antilichamen zijn essentiële hulpmiddelen gebleken om de pathofysiologie van TTP in vitro te onderzoeken en om dierenmodellen voor TTP te ontwikkelen. Het Laboratorium voor Trombose Onderzoek is gespecialiseerd in de ontwikkeling van monoclonale anti-humane ADAMTS13 antilichamen, die hebben geleid tot nieuwe inzichten in de structuur van ADAMTS13, het werkingsmechanisme van ADAMTS13 en de ADAMTS13 antigenen in patiënten. Ondanks hun hoge specificiteit, zijn monoclonale antilichamen gevoelig voor veranderingen in de epitoop of epitopen in het antigen, wat ook het gebruik in immunoassays gaat limiteren. Polyclonale antilichamen zullen daarentegen, verschillende epitopen van hetzelfde antigeen herkennen, waardoor ze minder vatbaar zijn voor veranderingen in het antigeen. Op deze manier hebben we in deze studie een polyclonaal anti-humaan ADAMTS13 antilichaam ontwikkeld met hoge specificiteit en gevoeligheid, en gevalideerd voor gebruik in immunoassays als ELISA, Western Blot en immunocytochemie (Doelstelling III). Tot slot worden dierenmodellen in TTP gebruikt om de pathofysiologische mechanismen onderliggend aan TTP te ontrafelen en om nieuwe therapeutische middelen te ontwikkelen. Daarom werden reagentia die specifiek kruisreageerden met ADAMTS13 van muizen ontwikkeld. In deze studie werd een antigeengebaseerde opzuivering van een eerder ontwikkeld polyclonaal anti-muis ADAMTS13 antibody, uitgevoerd (Doelstelling III). Dit proces verhoogde de zuiverheid van het antilichaam en zorgde voor een verrijking van de specifieke anti-muis ADAMTS13 antilichamen.

Dit doctoraat onderzocht de TTP-geletterdheid van patiënten en toonde aan dat toegenome leeftijd en een lagere opleidingsgraad geassocieerd zijn met laag ziektebegrip. Het blijkt dat niet alle patiënten zich bewust zijn van de oorsprong van de ziekte, het belang van de behandeling, de predisponerende factoren die een acute TTP-episode uitlokken en welke acties ondernomen moeten worden in een noodsituatie. Daarnaast werd een ELISA ontwikkeld om de epitopen van anti-spacer antilichamen in TTP-patiënten in kaart te brengen, hiermee werd aangetoond dat het spacer-domein drie hotspot regio’s voor antilichaambinding bevat. De bevindingen uit deze studie kunnen helpen in het ontwerpen van nieuwe therapieën met als doel om actief ADAMTS13, die aan de immuunrespons kan ontsnappen, te voorzien. Daarnaast toonden we aan dat de immuunrespons tegen het spacer-domein niet veranderde tijdens het ziekteverloop. Tot slot werd een polyclonaal anti-humaan ADAMTS13 antilichaam ontwikkeld, terwijl een antigeengebaseerde affiniteits-opzuivering van het polyclonale anti-muis ADAMTS13 antilichaam de specifieke anti-muis ADAMTS13 antilichamen aanrijkte.