Toepassen van correlatiespectroscopie voor het verkennen van celsignalisatie via dynamische analyse van plasmamembraanreceptoren

In een meercellig organisme worden alle processen van celgroei, proliferatie, beweging en gecontroleerde celdood strikt gereguleerd door celsignalering. Afzonderlijke cellen ontvangen signalen uit de omgeving en uit andere cellen en hun gedrag aan te passen. Deze signalen worden ontvangen door receptoreiwitten die meestal het celmembraan overspannen en een manier voor signalen van buiten de cel op veranderingen in de cel veroorzaken. De tyrosinekinasen superfamilie is een representatieve groep van dergelijke transmembraan-receptoren, vaarvan de epidermale groeifactor (EGF) receptor (EGFR) een van de meest gekende is. Wanneer EGF aan EGFR bindt, dimeriseert de receptor en wordt zijn intracellulaire kinasedomein geactiveerd. Deze dimerisatie is cruciaal voor het initiëren van signaaltransductie: zodra het kinasedomein geactiveerd is, kunnen de tyrosines in C-terminus van EGFR gefosforyleerd worden om bindingsplaatsen voor signaaltransductie eiwitten te creëren. In dit project hebben we raster image correlation spectroscopy (RICS) ondersteund met number and brightness (N&B) analyse gebruikt, om de EGFR monomeer-dimeer evenwicht op het plasmamembraan van levende cellen doorlopend te volgen. EGFR niet alleen dimeriseerde na EGF binding, ook de monomeer - dimeer verhouding varieerde met een periodiciteit van ongeveer 2,5 min. Dit resultaat toont aan dat de dimerisatie door een negatieve terugkoppeling wordt gecontrloreerd. In hoofdstuk 2.1 onderzochten we deze negatieve terugkoppeling en concluderen we dat het process afhankelijk is van de activiteit van verschillende signaaltransductieproteïnen (fosfolipase Cy, proteïnekinase C en proteïne kinase D (PKD)), maar dat het onafhankelijk is van Ca2+ signalering en endocytose. Door fosforylering van twee threonineresiduen (T654 en T669) in het juxtamembraandomein van EGFR verschuift het monomeer-dimeer evenwicht van ligand gebonden actieve EGFR naar monomere vorm. De dimerisatie toestand van de receptor is gecorreleerd met de activiteit van downstream signalering effectoren. Op basis van deze observaties stellen wij een nieuw negatieve terugkoppelingsmechanisme voor. Deze negatieve terugkoppeling regelt de EGFR-signalering via receptormonomerisatie. In hoofdstuk 2.2 combineerden we RICS met fosfotyrosine-immuunfluorescentie en live cell imaging van downstream signaaltransductie (Ca2+ en de activiteit van extracellulair signal-gereguleerde kinase, ERK), om verder de structurele aspecten van EGFR dimerisatie te onderzoeken: hydrofoob grensvlak (interface) tussen ontvanger en activator kinasedomeinen en “latch” tussen receiver juxtamembraandomein en activator kinasedomein. We bevestigden dat hydrofoob grensvlak cruciaal is voor EGFR-dimerisatie, fosforylering van tyrosineresten op de C-terminus en signaaltransductie via Ca2+ en ERK signaleringsroutes. Omdat zowel kinaseactiviteit als de beschikbaarheid van Y954 in het kinasedomein van de activator belangrijk zijn voor EGFR-dimerisatie en signalering, kunnen we concluderen dat autofosforylering van Y954 de asymmetrische dimeervorming vergemakkelijkt. Daarentegen, blijkt ook dat feedback fosforylering van de T669 in het juxtamembraan domein het dimer destabiliseert. Kortom, dit onderzoek geeft inzicht in EGFR-dimerisatieproces dat correleert met de uitvoer van vershillende signaleringsroutes an wordt gereguleerd door de autofosforylatie en feedback fosforylatie op de “latch” vormende domein.