Superresolutie fluorescentie microscopie gebaseerde technieken voor de studie van signaaltransductie.

Correcte communicatie is cruciaal om een boodschap door te geven. Om correcte communicatie te bereiken is het belangrijk dat zowel de verzender als de ontvanger van het signaal aanwezig zijn op het correct tijdstip en op de correcte plaats. In een cel zorgen signaaltransductiewegen voor de communicatie. Deze bestaan uit een sterk vertakt netwerk van proteïnen en signaalmoleculen die de signalen samenvoegen tot een finaal werkplan dat de cel gidst in zijn functies en daarbij zowel op korte als op lange termijn reacties bijstuurt. Daarom is de juiste verdeling in tijd en ruimte van de componenten van deze netwerken cruciaal voor het gedrag en het lot van de cel. Het is aangetoond dat single molecule fluorescentie microscopie een excellent middel is om de verdeling en het gedrag van individuele moleculen te bestuderen in tijd en ruimte en daarbij de detectie van heterogeniteit mogelijk maakt welke anders verloren gaat tijdens het uitmiddelen.

Het objectief van dit proefstuk was het uitbreiden van fluorescentie microscopie voor de studie van signaaltransductie in gecultiveerde zoogdiercellen op een hoge ruimtelijke resolutie alsook op een single molecule niveau met als casus de epidermale groeifactor  receptor (EGFR)/ mitogen activated protein kinase (MAPK) signaaltransductieweg.

De resultaten zijn verdeeld in twee delen. Het eerste deel, 'Fluorescente labels voor microscopie', handelt over het gebruik van een enkelvoudige emissieband voor optical highlighting met het fluorescent proteïne, LSSmOrange (hoofdstuk 5). Deze studie toont aan dat LSSmOrange kan gefotoconverteerd worden in een levende cel doormiddel van belichting met 'blauw' licht. Aangezien er een minimale binding met endogene proteïnen geobserveerd werd, is LSSmOrange geschikt voor optical highlighting in cellulo. Daarenboven konden highlighting experimenten gemakkelijk uitgebreid worden naar meerdere kleuren beeldvorming doordat de emissie band invariabel is. Verder kon LSSmOrange ruimtelijk begrensd gefotoconverteerd worden in drie dimensies met een femtoseconde laserpuls door middel van een twee fotonen proces.

Het tweede deel, 'Single molecule fluorescentie microscopie toegepast op signaaltransductie', bestaat uit hoofdstukken 6-8. Deze hoofdstukken handelen over single molecule methoden voor de studie van signaaltransductie. Proteïne-proteïne interacties (PPIs) vormen de basis van cellulaire processen die het lot van de cel reguleren. Deze PPIs kunnen extreem tijdelijk zijn. In hoofdstuk 6 werd een benadering om deze kort levende tijdelijke interacties op het plasmamembraan van een levende cel te detecteren ontwikkeld. Deze benadering is gebaseerd op de selectieve detectie van interagerende individuele moleculen. Dit was mogelijk door het verschil in mobiliteit tussen proteïnen op het membraan en in het cytosol waardoor een kleinere vervaging van het fluorescentie signaal wordt waargenomen. Het concept werd aangetoond door middel van een model systeem gebaseerd op modulaire proteïne domeinen die interageren met korte lineaire peptide motieven. Interagerende moleculen werden gedetecteerd en gelocalizeerd. Door het samenvoegen van alle lokalisaties kon een map van de interacties gemaakt worden. Deze benadering werd dan gebruikt voor het weergeven van interacties van verschillende proteïnen in het cytosol betrokken in de epidermal growth factor (EGF) signaaltransductie, met het plasmamembraan. Interactie mappen van Grb2, PLC-γ en c-Raf tonen dat deze moleculen interageren met verschillende compartimenten op het plasmamembraan. Dit illustreert de rol van membraan heterogeniteit in de ruimtelijke regulatie van cellulaire signaaltransductie.

In hoofdstuk 7, gebruikten we deze methode om de rol te onderzoeken van de ruimtelijke ordening van de receptor in clathrin coated pits (CCPs) op het plasmamembraan en vesikels (CCVs) in het cytosol. Clathrine gemedieerde endocytose (CME) dient om de activiteit van membraan receptoren te reguleren maar verschillende studies tonen aan dat deze compartementalisatie betrokken is bij signaaltransductie. Moleculen interageren met de receptor tijdens signaaltransductie. Om de rol van EGFR verrijkte CCPs en CCVs te bestuderen, hebben we de interacties van c-Raf gedetecteerd doorheen de cel samen met de EGFR en clathrine verdeling. Een analyse methode om de receptor verdeling te correleren met c-Raf interacties werd ontwikkeld. Er werd geen toegenomen aantal bindingen van c-Raf moleculen waargenomen in CCPs en CCVs. Dit geeft aan dat nog op het basaal plasmamembraan nog in het cytosol EGFR accumulatie in CCPs en CCVs een rol speelt als platform waar c-Raf moleculen efficiënt kunnen binnen en geactiveerd worden.

In het laatste hoofdstuk (hoofdstuk 8) wordt de moleculaire mobiliteit in verband gebracht met de cellulaire reactie. Een cel is een complex geheel en reactie van de cel kan heterogeen zijn tussen verschillende cellen. Deze reactie is gereguleerd op een moleculair niveau. Proteïnen, zoals receptoren op het plasmamembraan, bewegen en deze beweging is gerelateerd met moleculaire interacties en de omgeving van het proteïne. Om de moleculaire dynamica te analyseren in verband met de reactie van de cel, was een systeem ontwikkeld om functional imaging tijdens beeldopname voor single particle tracking (SPT) analyse uit te voeren. Dit systeem werd toegepast op de EGFR en de heterogene Ca2+ reactie bij een submaximale EGF concentratie. Verschillende diffusie eigenschappen van EGFR werden onthuld in reagerende en niet reagerende cellen. Deze verschillen kunnen een verschuiving van het monomeer-dimeer evenwicht van de EGFR weergeven.