Studie van osteoarthritis-geassocieerde genen in het zebravis- en kippenembryo.

Osteoarthrose (OA) is een aandoening van de synoviale gewrichten die miljoenen mensen ter wereld treft. Het is één van de belangrijkste oorzaken van verminderde mobiliteit en pijn bij ouderen. Kenmerken van de ziekte zijn een progressieve degradatie van het articulair kraakbeen en een geassocieerde aantasting van het subchondraal bot. De laatste jaren heeft men de genetische en omgevingsgerelateerde risicofactoren intensief onderzocht en een aantal genen die geassocieerd zijn met OA reguleren de ontwikkeling van bot en kraakbeen in het embryo. Dit heeft geleid tot de hypothese dat een reactivatie van embryonale signaalcascades een rol speelt in het ziekteproces. Toch heeft het hedendaags wetenschappelijk onderzoek nog niet geleid tot een therapie die het ziekteproces stopzet of omkeert.

De enorme impact op de levenskwaliteit en de steeds stijgende kosten die geassocieerd zijn  met OA, benadrukken de nood aan een verbeterde diagnostiek en uiteindelijk een therapie die de ziekte geneest. Met dit doel voor ogen werd een Europees wetenschappelijk consortium opgericht (“TREAT-OA”) dat verantwoordelijk was voor het identificeren van nieuwe genen die geassocieerd zijn met het ontstaan en de progressie van OA. Met behulp van “genome-wide associated scans (GWAS)” heeft het consortium nieuwe “single nucleotide polymorphisms (SNPs)” ontdekt die geassocieerd zijn met OA en die gelegen zijn in de COG5 cluster van genen. Deze cluster bevat zes genen, waaronder de G-proteïne gekoppelde receptor type 22 (GPR22). Aangezien GPR22 aanwezig is in de gewrichten van OA-muizenmodellen, maar niet in gezonde gewrichten, is het waarschijnlijk dat GPR22 betrokken is in het ziekteproces. Toch is de rol van GPR22 in OA nog steeds een punt van discussie en de biologische functie en regulatie van GPR22 blijft ongekend. Het onderzoeken van de biologische rol van GPR22 in een embryonaal model kan relevant zijn voor het begrijpen van de moleculaire basis van OA, want het is aangetoond dat een reactivatie van embryonale signaalcascades mee aan de basis ligt van de ziekte. Het zebravismodel is dus geschikt om de cellulaire processen en signaalcascades die gereguleerd worden door GPR22 te bestuderen in een eenvoudige en gestandardiseerde in vivo context, meer bepaald door de expressie van zebravis gpr22 te verhogen of te verlagen.

In deze studie toonden we aan dat een verlaging of verhoging van gpr22 expressie door injectie van morpholinos of gpr22 mRNA, respectievelijk, resulteerde in een defecte vorming van de links-rechts (LR) as in het zebravis embryo. Dit hield meer bepaald in dat de expressie van de links-specifieke genen (lefty1, lefty2, southpaw en pitx2a) van het lateraal-plaat-mesoderm (LPM) gerandomiseerd was, wat leidde tot een defecte LR-positie van het hart. Bovendien resulteerde de specifieke inactivatie van gpr22 in de Kupffer’s vesikel (KV) in hetzelfde fenotype, wat aantoont dat Gpr22 LR asymmetrie reguleert door zijn functie in de KV. Analyse van de cilia in de KV door immunofluorescentie en transmissie electronen microscopie (TEM) gaf veranderingen in de lengte en de structuur van de cilia weer. Een ontregeling van gpr22 expressie leidde ook tot defecten in andere organen die gekenmerkt zijn door cilia, zoals het binnenoor, de neuromast cellen en het olfactorisch systeem. Dit zou kunnen wijzen op een meer algemene rol van Gpr22 in ciliogenese, hoewel de exacte functie van Gpr22 in het reguleren van de cilia in deze organen niet onderzocht werd.

Onze bevinding dat Gpr22 betrokken is in ciliogenese, is ondersteund door studies die aantonen dat vele G-proteïne gekoppelde receptoren en hun effectoren gelokaliseerd zijn in de cilia, waar ze ciliogenese controleren. Het ontbreken van een zebravis Gpr22 antilichaam heeft ons echter belemmerd om de subcellulaire lokalisatie van het proteïne te onderzoeken in zebravis. We waren wel in staat om Gpr22 te detecteren in de proteïne-extracten van de cilia van een epitheliale niercellijn, afkomstig van het varken (CL4). Daarnaast bevatte de sequentie van het Gpr22 proteïne geconserveerde motieven voor het transporteren van proteïnes naar de cilia, meer bepaald de VxPx en AxxxQ motieven. Desondanks zijn vele regulators van ciliogenese niet per se gelokaliseerd in de cilia, zoals transcriptiefactoren, miRNAs of proteïnes die geassocieerd zijn met het centrosoom, de basale lichaampjes of actine.

Het is aangetoond dat de FGF signaalcascade een belangrijke regulator is van ciliogenese in meerdere epithelia. Fgf reguleert bijvoorbeeld de lengte van de cilia in de zebravis KV via het induceren van de expressie van foxj1a en rfx2. Onze data tonen echter aan dat Gpr22 de expressie of activiteit van deze transcriptiefactoren niet verandert, maar toch sluiten deze resultaten niet uit dat er een potentiële interactie bestaat tussen de Gpr22 en de Fgf signaalcascades. Inderdaad, een overexpressie van gpr22 resulteerde in ectopische signalisering van Fgf in de embryonale middenas en in de cellen die de KV omringen. Dit suggereert een interactie tussen de Gpr22 en Fgf signaalcascades in deze weefsels. Bovendien kon de gereduceerde lengte van de KV cilia in embryo’s die behandeld werden met de Fgf receptor type 1 inhibitor, SU5402, hersteld worden door een overexpressie van gpr22. Het is dus mogelijk dat de Gpr22 en Fgf receptoren interageren op intracellulair niveau via een nog ongekende gemeenschappelijke regulator om KV ciliogenese te controleren.

Een overexpressie van GPR22 in de HEK-293 cellijn leidde tot een inhibitie van adenylaat cyclase en bijgevolg een vermindering in PKA-activiteit. Eerdere studies rapporteerden dat PKA ciliogenese stimuleert en dat de activatie van PKA door het activeren van adenylaat cyclase resulteert in een verlenging van de KV cilia. Uitgaande van deze data zouden embryo’s met een overexpressie van gpr22 een vermindering van PKA-activiteit moeten hebben en dus, een reductie van de lengte van de cilia. Toch vertoonden deze embryo’s een verlenging van de KV cilia. Het is daarom waarschijnlijk dat Gpr22 de lengte van de KV cilia onafhankelijk van PKA reguleert. We ontdekten inderdaad dat de behandeling van zebravis embryos met PKA modulatoren niet het KV cilia fenotype, dat als gevolg van een gpr22 ontregeling ontstaat, kon nabootsen. Daarnaast kon de reductie in KV cilia lengte, zoals geobserveerd in embryo’s met een verlaagde gpr22 expressie, niet hersteld worden door een inhibitie van PKA. Op basis van de literatuur en onze eigen data is het daarom waarschijnlijk dat er geen directe interactie is tussen Gpr22 en PKA in KV ciliogenese, hoewel de experimenten moeten worden herhaald om een conclusie te kunnen vormen.

Aangezien we geen verandering konden waarnemen in het aantal KV cilia en aangezien de basale lichaampjes niet defect leken, is het mogelijk dat Gpr22 de groei en het behoud van de KV cilia controleert in plaats van de inductie van ciliogenese. Ondanks het groeiende aantal genen en signaalcascades die een effect hebben op ciliogenese, is het mechanisme om de lengte en structuur van cilia te behouden nog steeds ongekend. Een interessant theoretisch model is het “balance-point” mechanisme. Dit model gaat ervan uit dat de lengte van de cilia afhankelijk is van de efficiëntie van het intraflagullair transport (IFT). Gpr22 zou dus betrokken kunnen zijn in het controleren van het IFT en daardoor de structuur en lengte van cilia bepalen. Deze hypothese is ondersteund door onze bevinding dat de KV cilia gezwollen leken en gevuld met electrodens materiaal in embryo’s met een ontregeling van gpr22 expressie. Deze defecten worden vaak geassocieerd met mutaties in genen die coderen voor componenten of regulatoren van het IFT systeem, zoals de IFT proteïnes, de BBS proteïnes en de IFT motor-proteïnes. Additioneel bewijs dat G-proteïne gekoppelde receptoren in staat zijn om ciliogenese te reguleren via het IFT systeem, is afkomstig van een studie waarin ze aantoonden dat de EP4 receptor (enzyme cyclooxygenase-1 receptor) ciliogenese stimuleert door het boosten van het IFT transport. Toch zijn verdere experimenten nodig om de exacte rol van gpr22 in het controleren van het IFT systeem te begrijpen.

Het is mogelijk dat GPR22 het ziekteproces van OA beïnvloedt door zijn rol in ciliogenese, ondanks het feit dat de functie van GPR22 in OA nog steeds wordt betwijfeld. Vele studies toonden namelijk aan dat de cilia essentiëel zijn voor de ontwikkeling en de homeostase van het skelet, voornamelijk omdat ze onmisbaar zijn voor de HH en Wnt signaalcascades die kritiek zijn voor een normale ontwikkeling en behoud van bot en kraakbeen. Bovendien hebben cilia een rol als mechano- en chemosensoren, die ervoor zorgen dat het skelet in staat is om geschikt te reageren op veranderingen in de extracellulaire omgeving.

Samenvattend, ons onderzoek identifeerde een nieuwe speler in het veld van ciliogenese en zou de deuren kunnen openzetten voor verder onderzoek naar de functie van GPR22 en cilia in humane skeletaandoeningen of cilia-gerelateerde ziektes, zoals osteoartrose en de ciliopathieën.