< Terug naar vorige pagina

Project

Studie van de embryonale chromosomale instabiliteit en de oorsprong van structurele genetische variatie door genoomsequentie-analyse van individuele cellen van humane embryos.

Een cel beschikt over een assortiment aan producten om haar genetisch materiaal te beschermen, te inspecteren en -indien nodig- te repareren. Toch kunnen mutaties in het DNA verworven worden tijdens de levenscyclus van een cel. Dit wordt geïllustreerd door de verworven genetische fouten die aan de basis liggen van de ontwikkeling van kanker, maar ook door de geboorte van kinderen belast met genomische afwijkingen die ontstonden tijdens de gametogenese of de vroege embryogenese. Meer zelfs, de kans is groot dat we vroeg of laat in ons leven allemaal genetische mozaïeken zijn. Een deel van onze cellen heeft dan een genoom dat afwijkt van het originele genoom in de bevruchte eicel. Om de omvang en gevolgen van dit mozaïcisme te ontrafelen, is het belangrijk om alle soorten van genetische variatie in het hele genoom van een individuele menselijke cel in beeld te kunnen brengen. Zulke methoden zijn ook nodig om de onderliggende genomische instabiliteit tijdens processen als gametogenese, embryogenese en tumorgenese te onderzoeken.

Sequencen van individuele cellen is dus een belangrijke methode voor zowel fundamenteel genoomonderzoek als voor de ontwikkeling van klinische toepassingen (bv. genoomprofilering van circulerende tumorcellen geïsoleerd uit perifeer bloed van een kankerpatiënt voor het bijsturen van de behandeling van de patiënt). Bij de start van mijn doctoraat, bestond de methodologie nog niet. Voordat het genoom van een individuele cel kan geanalyseerd worden op platformen voor hoge doorvoer sequentie-bepaling moet het genoom van die cel duizenden malen geamplificeerd worden om voldoende startmateriaal te bekomen. Deze methoden voor ‘volledige genoom amplificatie’ (VGA) vormen een grote uitdaging, vermits ze een vervormd beeld van het originele genoom afleveren, verstoord met VGA-artefacten die op echte genetische varianten lijken. In hoofdstuk 4 van deze thesis ontwikkelden we een methode voor ‘paired-end’ sequencen van het genoom van individuele cellen, die gebruik maakt van ‘paired-end mapping’ en informatie van single nucleotide varianten om VGA-artefacten te onderscheiden van echte DNA kopij-aantal varianten. We toonden voor de eerste keer aan dat inter- alsook intrachromosomale structurele herschikkingen kunnen gedetecteerd worden in een individuele cel.

Naast VGA-artefacten vormt ook actieve DNA-replicatie een uitdaging voor genomica van individuele cellen. Een momentopname van een diploïde cel in S-fase vertoont afwisselend loci met kopij-aantal 2, 3 of 4. In hoofdstuk 3 van deze thesis gebruikten we comparatieve genomische hybridisatie op micro-roosters om aan te tonen dat actieve DNA-replicatie een negatief effect heeft op de betrouwbaarheid van DNA kopij-aantal bepaling. Als men cellen analyseert die willekeurig uit een populatie geïsoleerd werden –zonder voorkennis van hun status in de celcyclus-, kan dit leiden tot misinterpretatie van hun DNA kopij-aantal profiel. In hoofdstuk 5 ontwikkelden we een methode om cellen die zich in de S-fase bevinden te detecteren in een populatie van individuele diploïde cellen na sequencen. Daarnaast ontwikkelden we ook een methode om genoomwijd de progressie van DNA-replicatie in individuele cellen aan hoge resolutie in kaart te brengen d.m.v. sequencen.

Recent werd aangetoond dat de eerste klievingsdelingen van humane embryo’s na in vitro fertilisatie (IVF) vatbaar zijn voor chromosoom-instabiliteit (CIN)2. Verscheidene observaties suggereren dat in vivo humane embryogenese eveneens CIN ondergaat. In hoofdstuk 6 combineerden we genoomwijde sequentie bepaling van alle beschikbare individuele blastomeren van humane embryo’s met live-beeldvorming van de ontwikkeling van deze embryo’s vanaf de bevruchting. Sequencen van het genoom van elke cel, gecombineerd met waardevolle informatie over de celdeling, het gedrag van de cellen en de morfologie van het embryo, leverde dieper inzicht in de werking van CIN tijdens humane embryogenese. We ontdekten nieuwe vormen van chromosomale herschikking, waaronder interstitiële (sub-microscopische) kopij-aantal varianten, alsook nieuwe mechanismen van CIN, waaronder de absorptie van een poollichaampje door een blastomeer, gevolgd door vele breuken ter hoogte van het centromeer wanneer deze blastomeer deelde. Daarnaast leverden we bewijs voor ‘breuk-fusie-brug’ cycli tijdens de eerste celcycli van humane embryogenese, een mechanisme van DNA-herschikking dat frequent bij kankers geobserveerd wordt. Momenteel gaat men er in het algemeen van uit dat constitutionele de novo DNA-herschikkingen het resultaat zijn van pre-meiotische of meiotische fouten in de kiemlijn. Echter, afhankelijk van welke blastomeer bijdraagt tot de binnenste celmassa en de eigenlijke foetus, kan deze CIN tijdens de embryogenese een bron zijn van niet enkel zwangerschapsverlies, maar ook van genomische aandoeningen en constitutionele de novo structurele varianten, waaronder de novo DNA kopij-aantal varianten.

Om inzicht te verwerven in de evolutionaire conservering van CIN tijdens de embryogenese, bestudeerden we in hoofdstuk 7 de stabiliteit van het genoom op verschillende momenten tijdens de vroege embryogenese in muis. We vonden dat het genoom veel stabieler was dan dat we observeerden tijdens de humane embryogenese. Toekomstig onderzoek moet de moleculaire mechanismen die deze CIN veroorzaken achterhalen.

Datum:21 feb 2010 →  30 sep 2015
Trefwoorden:Genome stability, IVF, Embryo, Single cell, Genome sequencing
Disciplines:Andere biologische wetenschappen, Genetica, Systeembiologie, Moleculaire en celbiologie
Project type:PhD project