< Terug naar vorige pagina

Project

Structurele analyse van antilichaam gebaseerde profibrinolytica

Plasminogeen activator inhibitor-1 (PAI-1), een lid van de serine protease inhibitor superfamilie, is de belangrijkste fysiologische inhibitor van plasminogeen activatoren (PAs). Hiertoe bezit PAI-1 een flexibele reactieve centrum loop (RCL) die een substraat-nabootsende peptidesequentie presenteert, die wordt ingebracht in het actieve centrum van de PA. Na de vorming van het initiële complex wordt  het reactieve centrum gesplitst door de PA, wat een conformatieverandering induceert en de PA naar het andere uiteinde van het PAI-1 molecule verplaatst. Doordat daar de PA stevig tegen het oppervlak van het PAI-1 molecule wordt aangedrukt, wordt het actieve centrum van de PA vervormd. Door de vorming van een irreversibel PAI-1/PA complex remt PAI-1 de PA-gemedieerde plasminevorming en reduceert het de daaropvolgende afbraak van het fibrinenetwerk dat deel uitmaakt van bloedklonters. Als één van de belangrijkste antifibrinolytische proteïnen heeft PAI-1 een regulerende rol in de hemostase door overmatig bloeden te voorkomen. Door zijn werking zowel binnen als buiten het PA systeem, speelt PAI-1 bovendien een belangrijke rol in fysiologische processen die verband houden met wondgenezing, angiogenese, celmigratie en inflammatie, al dan niet door zijn functie. Toenemend bewijs suggereert echter een verband tussen verhoogde PAI-1 niveaus en een verscheidenheid aan pathologieën, waaronder hart- en vaatziekten, trombose, kanker, fibrose, neurodegeneratieve en leeftijdsgerelateerde aandoeningen. Geneesmiddelontwikkeling die zich specifiek richt op het inhiberen van PAI-1 is bijgevolg een veelbelovende therapeutische strategie voor de behandeling van PAI-1-gerelateerde pathologieën.

Inmiddels is er een zeer diverse verzameling PAI-1 inhibitoren ontwikkeld, waaronder peptiden, RNA-aptameren, kleine chemische moleculen, antilichamen, antilichaamfragmenten en nanobodies. Ondanks voortdurende inspanningen zijn tot op heden geen PAI-1 inhibitoren goedgekeurd voor therapeutisch gebruik bij mensen. Hoewel verschillende antagonisten in vitro en in vivo uitgebreid werden gekarakteriseerd, is er weinig bekend over het exacte moleculaire mechanisme waarmee deze inhibitoren PAI-1 binden of de activiteit ervan moduleren. Een beter inzicht in deze mechanismen is dus noodzakelijk voor de verdere optimalisatie van reeds bestaande PAI-1 inhibitoren of om het rationele ontwerp van peptide-gebaseerde of chemische PAI-1 inhibitoren mogelijk te maken. Het doel van deze studie was daarom het ophelderen van het moleculaire mechanisme van PAI-1 inhiberende nanobodies en chemische moleculen.

In de eerste twee hoofdstukken van dit werk hebben we de röntgenkristallografische structuren van PAI-1 in complex met drie inhiberende nanobodies, Nb42 en Nb64 (hoofdstuk I) en Nb93 (hoofdstuk II) opgehelderd. Samen met biochemische en biofysische karakterisering waren we in staat om drie verschillende mechanismen te onderbouwen waarmee deze nanobodies PAI-1 activiteit moduleren. Zowel Nb42 als Nb93 bleken direct te interfereren met de initiële interactie tussen PAI-1 en PAs, zij het op twee verschillende manieren. De structuren toonden aan dat Nb42 bindt aan een oppervlak op
PAI-1 dat normaal gesproken betrokken is in ‘exosite’ interacties met PAs, i.e., interacties waarbij het reactieve centrum van PAI-1 of het actieve centrum van de PA niet betrokken zijn. Door deze ‘exosite’ interactie te verstoren heeft Nb42 een destabiliserend effect op het initiële PAI-1/PA complex, wat weerspiegeld werd door de verhoogde snelheid van RCL insertie in aanwezigheid van Nb42. Daarentegen blokkeert Nb93 de PAs zowel de toegang tot het reactieve centrum alsook tot de ‘exosite’ regio’s in PAI-1. Het derde nanobody, Nb64, bindt nabij of op de positie waar de PA zich bevindt in het finale irreversibele complex. Deze bindplaats is dus gelegen aan de andere kant van het PAI-1 molecule ten opzichte van de RCL en de bindplaatsen voor Nb42 en Nb93. Noch de vorming van het initiële PAI-1/PA complex, noch de kinetiek voor de PAI-1/PA reactie werden beïnvloed door Nb64. Vermoedelijk voorkomt Nb64 de vervorming van de actieve site van PAs die leidt tot het vrijkomen van de PA van gesplitst PAI-1, en dus de omzetting van PAI-1 van een inhibitor naar een substraat voor de PA.

In hoofdstuk III werd gefocust op het bepalen van de röntgenkristallografische structuur van PAI-1 in complex met het ‘single-chain variable fragment’ (scFv) van substraat-inducerend monoklonaal antilichaam MA-33H1F7. Aangezien we enkel de structuur van scFv-33H1F7 konden bepalen, gebruikten we antilichaam-proteïne ‘docking’ om een model van het complex te genereren. Informatie uit biochemische experimenten werd gebruikt om de gegenereerde modellen te filteren. Het uiteindelijk geselecteerde model is grotendeels in overeenstemming met de beschikbare experimentele informatie.

In hoofdstuk IV onthulde de röntgenkristallografische structuur van PAI-1 in complex met chemische inhibitor TM5484 een bindingsplaats aan het oppervlak van het PAI-1 molecule die overeenstemt met de bindingsplaats voor vitronectine, een biologische ligand van PAI-1. Opmerkelijk is dat deze waargenomen bindingsplaats wezenlijk verschilt van de veronderstelde bindplaats beschreven in de literatuur. De geobserveerde bindingsplaats vormt een mogelijke rationele verklaring voor het inhibitiemechanisme dat werd waargenomen met behulp van biochemische testen, i.e., het induceren van substraatgedrag van PAI-1 en het verstoren van de interactie met PAs. Door te binden aan de vitronectine-bindingsplaats en het verstevigen van deze flexibele regio kan TM5484 substraatgedrag induceren en PAI-1 omzetten in een niet-reactieve vorm via allostere modulatie.

Als besluit kan gesteld worden dat de structurele studies aangevuld met biochemische testen de inhibitiemechanismen van PAI-1-inhiberende nanobodies en van een klasse chemische PAI-1 antagonisten heeft verhelderd. Bovendien kunnen de verkregen structuren van de PAI-1/inhibitor complexen een uitstekend startpunt zijn voor het ontwerp van nieuwe profibrinolytische therapieën.

Datum:1 okt 2015  →  30 sep 2020
Trefwoorden:profibrinolytics, antibody-based
Disciplines:Laboratoriumgeneeskunde, Palliatieve zorg en zorg rond het levenseinde, Regeneratieve geneeskunde, Andere basiswetenschappen, Andere gezondheidswetenschappen, Verpleegkunde, Andere paramedische wetenschappen, Andere translationele wetenschappen, Andere medische en gezondheidswetenschappen
Project type:PhD project