IN VITRO ANGIOGENE SPRUITKRACHTEN: Microscopisch in kaart gebrachte 4D matrix-verplaatsingsvelden gekoppeld aan actomyosine-gebaseerde krachtgeneratie van endotheelspruiten

Angiogenese - de vorming van nieuwe bloedvaten uit het reeds bestaande bloedvatenstelsel - komt voor in zowel fysiologische als pathologische omstandigheden en is een kenmerk van een breed scala aan ziekten. Tijdens spruitende angiogenese oefenen invasieve endotheelcellen cellulaire krachten uit op cel-cel en cel-matrix koppelingssites. Zowel het trekken van leidercellen aan de volgcellen, als het duwen van de volgcellen op de leidercellen, als beide, zijn gepostuleerd als mechanische krachten die ten grondslag liggen aan de uitgroei van de spruiten. De krachten tijdens het in vitro spruiten zijn echter nog nooit direct gemeten. Het ontcijferen van de krachten tijdens dit spruiten van nieuwe bloedvaten - een proces dat sterk afhankelijk is van actomyosine – vormt de sleutel om spruitende angiogenese te begrijpen.

In het kader van deze studie is eerst een in vitro model van angiogenese geselecteerd. Met dit basismodel worden de respectievelijke rollen van actine en myosine voor spruitende angiogenese onderzocht door de actomyosine-gebaseerde krachtgeneratie van spruitende endotheelcellen te remmen met kleine actieve molecules. Vervolgens wordt het in vitro model uitgebreid om actomyosine-afhankelijke cellulaire krachten te relateren aan vervormingen van de omringende matrix door middel van 4D verplaatsingsmicroscopie. 4D verplaatsingsmicroscopie combineert fluorescentiemicroscopie met beeldregistratie-algoritmen om cel-matrix mechanische interacties uit te drukken in termen van matrix deformaties. Uitbreidingen van het model omvatten o.a.: (1) Het microscopisch in kaart brengen van 4D matrixverplaatsingen rond in vitro spruiten (in x, y, z en tijd), (2) het induceren van een stressvrije referentietoestand van de matrix, door chemische inhibitie van de cellulaire krachten en (3) het berekenen van absolute verplaatsingen op basis van de microscopiegegevens door middel van beeldregistratie-algoritmen. Microscopisch in kaart gebrachte matrixverplaatsingen zijn hier onweerlegbaar gekoppeld aan de cellulaire krachten van de endotheelspruiten die groeien in de matrix.

Ten einde de kernvragen van de thesis te onderzoeken, wordt 4D-verplaatsingsmicroscopie vervolgens toegepast om verplaatsingsveldpatronen rond in vitro spruiten te analyseren in tijd en ruimte. Patronen worden onderzocht in relatie tot de morfologie en de dynamiek van de spruiten; dewelke mogelijk voorspellende variabelen zijn van de matrixverplaatsingen. Wederkerige patronen ontsluieren hoe in vitro endotheelspruiten mechanisch interageren met de matrix, en werpen licht op de trekkende versus duwende aard van de krachten die ten grondslag liggen aan de dynamiek van de uitgroeiende, invasieve en spruitende endotheelcellen. Verdere analyse van lokale verplaatsingsvelden rond dynamische uiteindes van de spruiten, bevestigt de dominante rol van trekkende krachten van de spruiten versus duwende krachten van de spruiten. Uiteindelijk zal het wiskundig berekenen van de groottes van deze spruitkrachten - waarvoor de mechanische eigenschappen van de matrix nodig zijn - leiden tot een nog dieper begrip van spruitende angiogenese, gezien dan vergelijkende studies mogelijk zijn tussen hydrogelen met verschillende mechanische eigenschappen. Met dit op het oog, wordt een stap verder genomen met de 4D verplaatsingsmicroscopie-analyse en als een proof of concept worden cellulaire krachten rond in vitro angiogene spruiten voor het eerst geschat.

Ten slotte maken modificaties aan het design van de microscopische stalen het mogelijk om 4D verplaatsingsmicroscopie uit te voeren met Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) in de plaats van met Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM). SPIM-gebaseerde verplaatsingsmicroscopie is veelbelovend voor het onderzoeken van snelle processen tijdens in vitro angiogenese - zoals de dynamiek van de uiteindes van de spruit  - omdat hiermee meerdere spruiten tegelijkertijd met een hoge temporele resolutie kunnen worden geregistreerd, terwijl de (voor de registratie-algoritmen) vereiste subcellulaire resolutie behouden blijft.

Samenvattend benadrukt dit onderzoek de sleutelrol van actomyosine-gebaseerde krachten voor in vitro spruitende angiogenese, koppelt het microscopisch in kaart gebrachte matrixverplaatsingen aan de cellulaire krachten van endotheelspruiten, en draagt het bij aan het ontcijferen van de wederkerige mechanische interactie tussen spruiten en hun micro-omgeving. Het wordt aangetoond dat 4D verplaatsingsmicroscopie (zowel met CLSM als SPIM) een kwantitatieve en mechanisch verantwoorde benadering biedt om de kennis in het veld uit te breiden, en voor het eerst worden krachten rond in vitro spruiten gerapporteerd.