Ruimtelijke-temporele dissectie van organel-specifieke y-secretase interactomen gebruikmakend van nanotechnologie

Vanaf het moment dat mutaties in de PSEN-genen die de ziekte van Alzheimer (ZA) veroorzaken werden ontdekt, staan hun eiwitproducten, presenilines (PSEN), in het middelpunt van de aandacht voor ZA-onderzoek. Terwijl hun functie als de katalytische component van het tetramere intramembraan protease, γ-secretase, werd beschreven, begonnen stukjes van de puzzel samen te vallen. Decennia later blijven er echter veel vragen over de biologie ervan, de exacte rol in de ontwikkeling van ZA en het potentieel als medicijndoelwit. γ-Secretase-biologie is een complex verhaal dat wordt beïnvloed door veel verschillende factoren. Verder inzicht hierin is nodig om nieuwe manieren te ontdekken om de γ-secretase-functie en daarmee de ontwikkeling van AD te moduleren. Daarom hebben we in dit proefschrift zowel de vorming van het tetramere γ-secretasecomplex als het interactoom ervan onderzocht.

De stoichiometrische samenstelling van γ-secretase is een cruciale stap in de maturatie ervan. Door fractionering met complementaire ultracentrifugatiemethoden te gebruiken, toonden we aan dat alhoewel volledige complexen aanwezig waren in tussenliggende compartimenten, in het endoplasmatisch reticulum (ER) alleen immature subcomplexen werden waargenomen. Door middel van in vitro budding assays isoleerden we coat protein comlex II (COPII) vesikels, waardoor we ER-exit konden bestuderen. We toonden aan dat γ-secretase het ER niet verlaat in volledig complex, maar als monomere subeenheden en dimere subcomplexen (nicastrine (NCT) met anterior pharynx defective-1 (APH1) en PSEN1 met presenilin enhancer-2 (PEN-2)). Bovendien hebben NCT en PSEN1 verschillende voorkeuren voor verschillende Sec24-isovormen, waarbij de ER-exit van NCT wordt gemedieerd door Sec24C/D en de ER-exit van PSEN1 door Sec24A. De verpakking van PSEN1 in COPII-vesikels door Sec24A werd gemedieerd door een DPE-motief dat verloren gaat in de AD-geassocieerde PSEN1∆E9-variant. De vorming van subcomplexen verhoogde de stabiliteit van de subeenheden en de lokalisatie aan het celoppervlak. Onze gegevens ondersteunen een model waarin vorming van dimere subcomplexen en Sec24 paraloge selectiviteit de stapsgewijze assemblage van γ-secretase defineerd en als zodanig de uiteindelijke niveaus van γ-secretase-activiteit in de cel controleerd.

Daarna gingen we naar interactomics om lokalisatie-specifieke interactoren te identificeren. Eerdere resultaten van ons laboratorium beschreven de verschillende subcellulaire lokalisaties van PSEN1/- en PSEN2/γ-secretase, waarbij PSEN1/γ-secretase breed doorheen de cel is verpsreid en PSEN2/γ-secretase beperkt is tot late endosomen en lysosomen. Het muteren van het PSEN2-specifieke transportmotief dat verantwoordelijk is voor de lokalisatie ervan, leidde tot de generatie van twee PSEN2-transportmutanten met veranderde subcellulaire lokalisaties. We hebben eerst geprobeerd lokalisatie-specifieke interactoren te identificeren door het interactoom van wildtype PSEN2 te vergelijken met beide PSEN2-transportmutanten. We vonden een interessante interactie met de lysosomale protonpomp, maar zagen geen duidelijke lokalisatieafhankelijke interacties. Daarom hebben we late endosomen en lysosomen geïsoleerd als een startfractie voor interactoomisolatie, om lysosomale specifieke interacties te identificeren. Hierdoor konden we ClC7, een lysosomale Cl-/H+ -uitwisselaar, identificeren als een interactor van PSEN2/γ-secretase en de lysosomale protonpomp. γ-Secretase beïnvloedt ClC7-lokalisatie, aangezien PSEN dubbele knock-out (PSENdKO) resulteerde in verminderde lysosomale ClC7, die kon worden gered door ofwel PSEN1 of PSEN2. We ontdekten ook dat overexpressie van ClC7 een endosomaal pH-defect in PSENdKO-cellen kon redden. Met deze resultaten hebben we de PSEN/ClC7-interactie gekoppeld aan intraluminale ionenhomeostase.

Om het γ-secretase-interactoom dieper te onderzoeken, hebben we gebruik gemaakt van twee orthogonale interactomics-methoden: affiniteitsopzuivering met de GFP-tag en nabijheidsafhankelijke biotinylatie met de APEX2-tag. Deze benadering stelde ons in staat verschillende eiwitten te identificeren die γ-secretase koppelen aan lysosomale functies. We vonden een directe interactie tussen PSEN2/γ-secretase, Lamtor1 en RagC, beide eiwitten die betrokken zijn bij mTORC1-activering door middel van nutriëntendetectie. We bevestigden een rol voor PSEN2 in dit proces door een verhoogde mTORC1-activering in PSEN2KO-cellen te meten. Interessant is dat we ontdekten dat lysosomaal transport, dat is gekoppeld aan mTORC1-activering, werd beïnvloed in PSEN2KO-neuronen. Ten slotte beschreven we ook colokalisatie van lysosomaal PSEN2/γ-secretase en ER-gelokaliseerd reticulon-3 in ER-lysosoom-contactsites. Deze lokalisatie van PSEN2/γ-secretase op membraancontactplaatsen kan een spannende link vormen tussen ER-lysosoomcommunicatie, nutriëntendetectie en ionenhomeostase.