Rol van PACAP bij patiënten met nefrotisch syndroom.

Patiënten met nefrotisch syndroom (NS) hebben een verhoogd risico zowel op diepe veneuze als arteriële trombose, hetgeen de morbiditeit en mortaliteit significant doet toenemen. Herhaaldelijk werd aangetoond dat bloedplaatjes van patiënten met nefrotisch syndroom hyperactief zijn en dat hun aantal verhoogd is. De mechanismen die aan de basis liggen van deze veranderingen in aantal en functionaliteit van bloedplaatjes in NS werden echter nog niet opgehelderd. Een tiental jaar geleden werd ontdekt dat pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) een inhibitor is van megakaryopoiese en bloedplaatjesaggregatie, en dat inhibitie van PACAP of de PACAP receptoren leidt tot stimulatie van bloedplaatjesproductie en -activatie. In deze doctoraatsthesis werd de rol van PACAP bestudeerd in het toegenomen aantal en de hyperactivatie van bloedplaatjes in kinderen met NS.

Eerst werd een kleinschalige studie uitgevoerd in 4 patiënten met Fins type congenitaal NS (CNS). Daarna werden onze bevindingen gevalideerd in een prospectieve multicentrische studie in een groep van 24 patiënten met steroïd-sensitief idiopathisch nefrotisch syndroom (INS). Zowel in CNS als INS patiënten vonden we plasma PACAP deficiëntie terug tijdens het nefrotisch stadium, als gevolg van excessieve urinaire excretie. De plasma PACAP deficiëntie was meer uitgesproken in de CNS dan INS patiënten. We stelden verder vast dat in vitro megakaryopoïese verhoogd was gedurende het PACAP deficiënte stadium bij CNS patiënten, en dat dit effect kon tegengegaan worden indien recombinant PACAP werd toegevoegd. Trombocytose werd geobserveerd in alle CNS patiënten en in sommige patiënten met INS tijdens de nefrotische fase. Verder werd aangetoond dat NF-κB, een downstream target van PACAP, verlaagd was in bloedplaatjeslysaten van CNS patiënten. Ook bloedplaatjeshyperaggregatie werd vastgesteld bij CNS en INS patiënten in de nefrotische fase. In INS patiënten werd verder gezien dat de toevoeging van recombinant PACAP tijdens de nefrotische fase aan het bloeplaatjesstaal, leidt tot een vermindering van de bloedplaatjesaggregatie. Bovendien werd een omgekeerd correlatie aangetoond tussen bloedplaatjesaggregatie en plasma PACAP waarden, maar niet tussen bloedplaatjesaggregatie en serum albumine concentratie. Onze observaties wijzen sterk op een rol voor plasma PACAP deficiëntie in de verhoogde megakaryopoïese en de toegenomen bloedplaatjesactivatie in NS.

Om het effect van PACAP deficiëntie op bloedplaatjes in NS verder te bestuderen, werden twee CNS zebravis modellen onderzocht. Twee vroeger reeds gekarakteriseerde CNS modellen, één op basis van depletie van nefrine en een ander op basis van blootstelling aan adriamycine, werden bekomen in Tg(cd41:EGFP) transgene zebravis embryos. PACAP deficiëntie werd enkel bevestigd in het adriamycine model. Anders dan in onze bevindingen bij de mens echter, vonden we geen verhoogd bloedplaatjesaantal terug in deze zebravismodellen. Deze modellen konden dus niet verder gebruikt worden voor de studie van de rol van PACAP deficiëntie in megakaryopoïese in CNS.

Verder werd vroeger ook aangetoond in verschillende renale pathologie modellen, dat PACAP ook een nefroprotectief effect uitoefent. Er is echter weinig geweten over de expressie van PACAP en zijn receptoren in de nier. Ook is er niets bekend over de rol van PACAP in proteïnurie gerelateerde nierschade. In deze doctoraatsthesis werd de expressie van PACAP en zijn receptoren bestudeerd in de gezonde en nefrotische nier. Bovendien werd de rol van PACAP nagegaan in proteïnurie gerelateerde schade van proximale tubulaire cellen. Expressie van de VPAC1 receptor werd aangetoond in de proximale tubuli en glomeruli van gezond en nefrotisch humaan nierweefsel. Verder werd ook een zeer zwakke expressie van PACAP teruggevonden in de proximale tubuli van gezond nierweefsel, terwijl een veel sterker signaal werd gezien in de proximale tubuli van kinderen met NS, waarschijnlijk als gevolg van reabsorptie van PACAP aanwezig in het ultrafiltraat. Ook toonden we expressie van een functionele VPAC1 receptor aan in humane proximale tubulaire HK-2 cellen. VPAC2 expressie was afwezig en PAC1 expressie was zeer zwak in HK-2 cellen, wat suggereert dat VPAC1 de belangrijkste actieve receptor is in deze cellen. Verder onderzochten we het effect van PACAP op HK-2 cellen blootgesteld aan albumine, om proteïnurie gerelateerde celschade na te bootsen. Toevoeging van recombinant PACAP had geen invloed op de afgenomen celviabiliteit en toegenomen TGF-β1 expressie als gevolg van albumine blootstelling.