< Terug naar vorige pagina
Project
Proteïnen Tyrosine Fosforylatie in de Ontwikkeling van Kanker en Toepassingen voor Onderzoek
Proteïnen tyrosine fosforylatie is een belangrijk mechanisme van signaaltransductie, die verschillende cellulaire functies zoals proliferatie, overleving, differentiatie, adhesie en migratie controleert. Dit proces van proteïnen tyrosine fosforylatie is een omkeerbare posttranslationelemodificatie die gereguleerd wordt door proteïnen tyrosine kinasen (PTKs) en proteïnen tyrosine fosfatasen (PTPs). Verstoring van dit nauw gereguleerd proces draagt bij tot de ongecontroleerde groei van cellen en de ontwikkeling van tumoren.</>
</>
In het eerste deel van dit manuscript beschrijf ik de ontwikkeling van een screeningssysteem voor de selectie van functionele shRNAs en siRNAs door gebruik te maken van de transformerende capaciteit van een verkorte vorm van de PDGFRα receptor tyrosine kinase in de leukemie cellijn Ba/F3. Deze screen identificeerde werkzame shRNAs en siRNAs gericht tegen de Pten</> en Cdkn2a</> genen, welke wanneer gekloneerd op hetzelfde transcript als de oncogene PDGFRα</> zorgden voor de degradatie van dit transcript. Dit verlies van PDGFRα verhinderde de proliferatie van de Ba/F3 cellen, wat een kwantitatieve en gemakkelijke read-out is voor de selectie van werkzame shRNAs en siRNAs. Bijkomende voordelen van dit screeningssysteemzijn de onafhankelijkheid van de verkregen transductie efficiëntie en de mogelijkheid tot uitsluiten van toxische effecten na toevoeging van deIL-3 groeifactor.</>
</>
In het tweede deel van dit manuscript bestuderen we de rol van PTPRD als een mogelijke tumorsuppressor in ALL. We observeerden een hoog aantal heterozygote deleties van PTPRD</> in ALL stalen, maar vonden geen correlatie tussen de gen expressie en het aantal kopijen. Dit stelde de rol van PTPRD als tumorsuppressor in vraag. Vaak omvatten de PTPRD</> deleties ook het CDKN2A</> locus, een welgekende tumorsuppressor, wat een verklaring kan zijn voor de wanverhouding tussen de expressie en het aantal kopijen. Nochtans kan de rol van PTPRD in de hematopoëse niet volledig worden uitgesloten, gezien de hoge expressie van PTPRD in ongedifferentieerde hematopoëtische cellen en gezien de vastgestelde defecten in de milt in de Ptprd</> knockout muizen. Verder bevestigden we STAT1 en STAT3 als neerwaarts gelegen signaalproteïnen van PTPRD in 293T cellen. Een mogelijke rol als tumorsuppressor van PTPRD werd verder bestudeerd in melanoma, aangezien eerder werd gerapporteerd dat PTPRD</> in 12% van de melanoma stalen gemuteerd is. De expressie niveaus van PTPRD waren echter zeer laag in melanoma stalen en in melanocyten en correleerden niet met het aantal kopijen. Daarenboven lekende beschreven mutaties eerder passenger mutaties te zijn door hun verspreide ligging over gans het gen in zowel intronen als exonen, wat de beschreven rol van PTPRD als tumorsuppressor verder in vraag stelt.</>
</>
In het laatste deel gebruikten we phospho-proteomics om andere signaalwegen dan JAK/STAT te identificeren die door PTPN2 gereguleerd worden. Van de kandidaat proteïnen leek PTK2B een bonafide neerwaartsgelegen signaalproteïne te zijn van PTPN2, die snel geactiveerd werd naIL-2 en IL-7 cytokine stimulatie in leukemie cellen. Activatie van PTK2B bleek afhankelijk te zijn van de SRC kinasen en werd negatief gereguleerd door PTPN2. Inactivatie van PTK2B door siRNA-gemedieerde knockdown of door SRC inhibitors had echter geen effect of celgroei of -migratie.</>
</>
In het eerste deel van dit manuscript beschrijf ik de ontwikkeling van een screeningssysteem voor de selectie van functionele shRNAs en siRNAs door gebruik te maken van de transformerende capaciteit van een verkorte vorm van de PDGFRα receptor tyrosine kinase in de leukemie cellijn Ba/F3. Deze screen identificeerde werkzame shRNAs en siRNAs gericht tegen de Pten</> en Cdkn2a</> genen, welke wanneer gekloneerd op hetzelfde transcript als de oncogene PDGFRα</> zorgden voor de degradatie van dit transcript. Dit verlies van PDGFRα verhinderde de proliferatie van de Ba/F3 cellen, wat een kwantitatieve en gemakkelijke read-out is voor de selectie van werkzame shRNAs en siRNAs. Bijkomende voordelen van dit screeningssysteemzijn de onafhankelijkheid van de verkregen transductie efficiëntie en de mogelijkheid tot uitsluiten van toxische effecten na toevoeging van deIL-3 groeifactor.</>
</>
In het tweede deel van dit manuscript bestuderen we de rol van PTPRD als een mogelijke tumorsuppressor in ALL. We observeerden een hoog aantal heterozygote deleties van PTPRD</> in ALL stalen, maar vonden geen correlatie tussen de gen expressie en het aantal kopijen. Dit stelde de rol van PTPRD als tumorsuppressor in vraag. Vaak omvatten de PTPRD</> deleties ook het CDKN2A</> locus, een welgekende tumorsuppressor, wat een verklaring kan zijn voor de wanverhouding tussen de expressie en het aantal kopijen. Nochtans kan de rol van PTPRD in de hematopoëse niet volledig worden uitgesloten, gezien de hoge expressie van PTPRD in ongedifferentieerde hematopoëtische cellen en gezien de vastgestelde defecten in de milt in de Ptprd</> knockout muizen. Verder bevestigden we STAT1 en STAT3 als neerwaarts gelegen signaalproteïnen van PTPRD in 293T cellen. Een mogelijke rol als tumorsuppressor van PTPRD werd verder bestudeerd in melanoma, aangezien eerder werd gerapporteerd dat PTPRD</> in 12% van de melanoma stalen gemuteerd is. De expressie niveaus van PTPRD waren echter zeer laag in melanoma stalen en in melanocyten en correleerden niet met het aantal kopijen. Daarenboven lekende beschreven mutaties eerder passenger mutaties te zijn door hun verspreide ligging over gans het gen in zowel intronen als exonen, wat de beschreven rol van PTPRD als tumorsuppressor verder in vraag stelt.</>
</>
In het laatste deel gebruikten we phospho-proteomics om andere signaalwegen dan JAK/STAT te identificeren die door PTPN2 gereguleerd worden. Van de kandidaat proteïnen leek PTK2B een bonafide neerwaartsgelegen signaalproteïne te zijn van PTPN2, die snel geactiveerd werd naIL-2 en IL-7 cytokine stimulatie in leukemie cellen. Activatie van PTK2B bleek afhankelijk te zijn van de SRC kinasen en werd negatief gereguleerd door PTPN2. Inactivatie van PTK2B door siRNA-gemedieerde knockdown of door SRC inhibitors had echter geen effect of celgroei of -migratie.</>
Datum:1 sep 2010 → 31 dec 2014
Trefwoorden:T-cell, Cancer, Acute lymhoblastic, Leukemia
Disciplines:Medische beeldvorming en therapie, Andere paramedische wetenschappen, Genetica, Systeembiologie, Moleculaire en celbiologie
Project type:PhD project